一種高產(chǎn)胞外多糖的假單胞菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及微生物多糖領域，設及一種高產(chǎn)胞外多糖的假單胞菌株及其應用，具 體設及一種高產(chǎn)胞外多糖的假單胞菌(Pseudomonas SP. )SFEP-01及其培養(yǎng)方法W及在發(fā) 酵制備微生物胞外多糖中的應用。
【背景技術】
[0002] 微生物多糖在細胞內(nèi)主要有Ξ種存在形式:①黏附在細胞表面上，即胞壁多糖;② 分泌到培養(yǎng)基中，即胞外多糖;③構成微生物細胞的成分，即胞內(nèi)多糖;而其中的胞外多糖 具有產(chǎn)生量大、易于與菌體分離、可通過深層發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢。
[0003] 微生物胞外多糖化xtracellular polysaccharides,EPS)是微生物在生長過程中 為適應周圍環(huán)境的變化產(chǎn)生的一種對自身具有保護作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和 植物多糖相比較具有W下優(yōu)勢:①生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域、病蟲害等條件的限制;②具 有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景;③應用廣泛。目前已有多種微生物胞外多糖已經(jīng) 發(fā)展成為一類新型的發(fā)酵產(chǎn)品，作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、保濕劑、膠凝劑、懸浮劑等廣 泛應用于石油、化工、食品和制藥等多個領域。近年來有關海洋微生物和乳酸菌微生物胞外 多糖研究活躍，不斷有新型多糖結構被鑒定。微生物多糖作為天然活性大分子，在生物醫(yī)藥 領域的潛在應用價值也日益受到人們的廣泛關注。新菌種的進一步探索成為新型胞外多糖 的一個重要來源。
[0004] CN102816724B公開了一株放射形根瘤菌，其產(chǎn)生主要由半乳糖和葡萄糖組成的胞 外多糖，其胞外多糖水溶性好，且在低濃度下具有良好的粘度、表面活性、蛋白質可混性W 及良好的穩(wěn)定性和乳化性。
[0005] CN102965318B公開了一種產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌，該菌株在42°C條件下用M17 培養(yǎng)液發(fā)酵30小時產(chǎn)胞外多糖148mg/l，胞外多糖可明顯提高發(fā)酵乳的粘度和凝膠強度。
[0006] CN104232548A公開了一株假單胞菌，其合成的凝膠多糖為胞外多糖，將發(fā)酵條件 優(yōu)化，凝膠多糖產(chǎn)量可達5.94g/L。
[0007] 如何開發(fā)生產(chǎn)胞外多糖的新菌種、開發(fā)新型的胞外多糖W及提高胞外多糖的產(chǎn) 量，是微生物多糖領域技術人員面臨的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引在現(xiàn)有技術已有開發(fā)微生物多糖的基礎上，本發(fā)明提供一株高產(chǎn)細菌胞外多糖的 假單胞菌。該菌株能夠轉化甘油、葡萄糖、淀粉、巧樣酸鋼等產(chǎn)生凝膠型胞外多糖。
[0009] 本發(fā)明的一個目的是提供一株高產(chǎn)胞外多糖的假單胞菌（Pseudomonas sp.) SFEP-01，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、(CCTCC)，保藏日期為2016年1月14日，保 藏編號為CCTCC N〇:M2016035,保藏地址：中國武漢武漢大學。
[0010] 本發(fā)明所述假單胞菌SFEP-01是從海洋真菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的發(fā)酵培養(yǎng)污染物中采 用常規(guī)方法分離篩選得到，其具有如下生物學特征：
[0011] 菌株SFEP-01菌落及形態(tài)特征：固體培養(yǎng)菌落圓形，凸起，邊緣整齊，表面光滑，淡 黃色、半透明狀;30°C培養(yǎng)24小時，菌落直徑約1mm，培養(yǎng)48小時，菌落直徑約3-5mm(菌落形 態(tài)見附圖1，附圖2);菌株SFEP-01為桿菌，不形成芽胞，菌體形態(tài)直或稍彎、兩端形狀不規(guī) 貝1J，大小0.5~0.祉mX 1.5~3. Ομπι(菌體形態(tài)見附圖3)，液體培養(yǎng)12小時染色可見菌體外多 糖物質(見附圖4)。
[0012] 菌株SFEP-01生理生化特征是:革蘭氏染色陰性，好氧，最適生長溫度28-30°C，在 25Γ生長良好;利用葡萄糖、果糖、巧樣酸鹽，接觸酶陽性;生理生化實驗結果詳見表1。
[0013] 表1菌株SFEP-01的部分生理生化特征
[0016] 注：V'生長良好或呈陽性；不生長或呈陰性。
[0017] 上述用于菌體形態(tài)觀察的液體培養(yǎng)基組成（g/L):蛋白腺10,牛肉膏5,氯化鋼3， 抑7.0-7.2,蒸饋水配制。
[0018] 上述用于菌落形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成(g/L):蛋白腺10,牛肉膏5,氯化鋼3,瓊 脂15-20，抑7.0-7.2，蒸饋水配制。
[0019] 上述形態(tài)特征觀測的實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定 手冊》，科學出版社，2001，第一版，P353-363。
[0020] 上述生理生化試驗培養(yǎng)基及實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊》，科學出版社，2001，第一版，P364-398。
[0021] W本發(fā)明的菌株SFEP-01的全基因組DNA為模板，采用細菌16 SrDNA通用引物PCR擴 增該菌株16S rRNA基因序列，擴增產(chǎn)物測序得到長度為1399bp的序列（如序列表SEQ ID NO: 1所示），使用美國生物工程信息中屯、（National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株S陽P-01 16S rRNA的基因序列與 NCBI注冊的多株淺黃色假單胞桿菌(Pseudomonas luteola)和一些未被完全鑒定的假單胞 菌的16S rRNA的基因序列具有99%的同源性，生理生化試驗結果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定鑒 定手冊》中淺黃色假單胞桿菌的特征符合度較高（參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌 系統(tǒng)鑒定手冊》科學出版社，2001，第一版，P172)，系統(tǒng)發(fā)育樹表明該菌株與已知淺黃色假 單胞桿菌親緣關系與其他未鑒定假單胞桿菌菌株(Pseudomonas sp.)沒有顯著區(qū)別，因此， 將該菌株初步鑒定為假單胞菌菌種(Pseudomonas sp.)。
[0022] 本發(fā)明的另一目的是提供假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01在制備細菌胞外 多糖中的應用。
[0023] 本發(fā)明另一目的是提供一種假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發(fā)酵胞外多糖 的方法，步驟如下：
[0024] (1)將假單胞菌S陽P-01接種于新鮮斜面菌種培養(yǎng)基上，25-30°C培養(yǎng)1-2天得活化 菌體；
[0025] (2)將步驟(1)制得的活化菌體接種于液體種子培養(yǎng)基中，25-30°C培養(yǎng)8-24小時， 得種子液；
[0026] (3)將步驟(2)制得的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25-30°C發(fā)酵48-72小時至發(fā)酵 液呈凝膠狀，得胞外多糖發(fā)酵液。
[0027] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )S陽P-01斜面菌種培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖20- 50，酵母浸粉2-5，氯化鋼2-5，瓊脂粉15-20，pH值調至7.0-7.2。
[0028] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01液體種子培養(yǎng)基為（g/L):碳源10- 60，酵母浸粉3-6，氯化鋼2-5，玉米漿粉3-5，硫酸錠1-2，調整抑值7.0-7.2。
[00巧]上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/L):碳源40-80,酵 母浸粉3-6，氯化鋼5-8，玉米漿粉3-5，硫酸錠1-2，調整抑值7.0-7.2。
[0030] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01液體種子培養(yǎng)基和產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵 培養(yǎng)基中，碳源可選甘油、葡萄糖、薦糖、淀粉、乳糖、巧樣酸鹽等，優(yōu)選為甘油。
[0031] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為 28±2°C。
[0032] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01液體種子培養(yǎng)時間優(yōu)選為12-14小 時。
[0033] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)時間優(yōu)選為60- 70小時。
[0034] 本發(fā)明對于假單胞菌(Pseudomonas SP. )SFEP-01胞外多糖進行了組分分離及初 步定性：
[00巧]假單胞菌(Pseudomonas sp. )S陽P-01發(fā)酵得到的發(fā)酵液加水稀釋，離屯、取上清濃 縮至原體積，加乙醇沉淀，收集沉淀干燥即獲得胞外多糖粗品。取的SFEP-01菌株胞外多糖 粗品，加適量化is-HCl緩沖液溶解分散，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離，經(jīng) 檢測得到兩個分離組分:E