分泌抗南方菜豆花葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種分泌抗南方菜豆花葉病毒單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是南方菜豆花葉病毒屬 (Sobemovirus)的典型成員，主要包括SBMV-B和SBMV-C兩個(gè)株系，最早由Zaumeyer和化；rter 發(fā)現(xiàn)報(bào)道。該病毒主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)也有分布，可W感染危害大豆、菜 豆、南瓜等植物。南方菜豆花葉病毒病在田間普遍發(fā)生，傳播途徑多，危害嚴(yán)重。自然狀況下 可引起菜豆、班豆、黑綠豆和大豆的花葉、斑駁病害，導(dǎo)致花、果、種子數(shù)量下降，產(chǎn)量降低。 丹麥、澳大利亞、埃及、東非等一些國(guó)家和地區(qū)將其列為檢疫對(duì)象。我國(guó)具有扎根、繁殖、擴(kuò) 散的條件，一旦傳入，后患無(wú)窮。目前，已將其列入我國(guó)二類檢疫性有害生物，并從1992年起 依法實(shí)施檢疫。
[0003] SBMV病毒粒子為等軸對(duì)稱的二十面體(Τ = 3)，無(wú)包膜，直徑約為30nm。其基因組包 含一分子線狀單鏈正義RNA，長(zhǎng)約4100-4500nt，約占病毒粒子重量的21 %。SBMV在CsCl中的 浮力密度為1.36g/cm3,沉降系數(shù)為115S。病毒的致死溫度為90-95°C，稀釋限點(diǎn)為10-5-10- 6， 體外存活期（18-22°C)為1.65-20d。病毒RNA的3'端既無(wú)化ly(A)，也無(wú)類似tRNA結(jié)構(gòu)，其5' 端有一個(gè)VPg，可能是病毒侵染所必需的，含有4個(gè)0RF，0RF1編碼一個(gè)21kDa的P1蛋白，該蛋 白與病毒的胞間運(yùn)動(dòng)有關(guān);0RF2編碼的10化化P2蛋白可能是聚合酶;0RF3位于0RF2之內(nèi)， 編碼一個(gè)18kDa蛋白，其功能還未知;0RF4編碼30kDa的外殼蛋白。
[0004] 該病毒粒子主要存在于寄主植物葉肉細(xì)胞中，常分散分布或聚集在細(xì)胞質(zhì)和液泡 中。SBMV侵染的植株細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大片病毒結(jié)晶體，并產(chǎn)生許多含有細(xì)的纖維狀物的特殊 小泡結(jié)構(gòu)。感染細(xì)胞呈現(xiàn)囊泡化，葉綠體受擠壓變形，但在葉綠體和線粒體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒 粒子。SBMV的寄主范圍很窄，多為豆科植物，自然寄主為菜豆和班豆，其中SBMV-B株系能侵 染菜豆的大多數(shù)品種，而株系SBMV-C只能侵染班豆。其人工接種寄主相對(duì)廣泛，可侵染大 豆、綠豆、赤小豆、紅花菜豆、棉豆、魏豆、蠶豆、草木禪等約12個(gè)屬23種植物。侵染菜豆后引 起的致病癥狀主要包括斑駁和花葉，但不同品種上的癥狀差異很大，有的為系統(tǒng)發(fā)病，有的 是局部發(fā)病，有的癥狀輕微，有的還伴隨皺縮和沿脈變色等癥狀。SBMV在田間主要通過(guò)葉甲 進(jìn)行傳播，也可通過(guò)汁液機(jī)械方式和種子傳播。
[0005] 目前，菜豆、班豆等豆科植物在我國(guó)種植面積大、范圍廣，且隨著進(jìn)出口貿(mào)易和種 質(zhì)交換日益增多，此病毒的傳入機(jī)會(huì)也大大增加，為了保護(hù)我國(guó)豆類作物的生產(chǎn)，防止該病 毒自境外傳入國(guó)內(nèi)，應(yīng)建立一套簡(jiǎn)便、快速、行之有效的檢疫檢測(cè)方法。當(dāng)前，對(duì)于SBMV的口 岸檢測(cè)，一般采用生物學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)和電鏡檢測(cè)技術(shù)，運(yùn)幾種方法效率低，并不 適合大批量樣品檢測(cè)。血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，特異性好，同時(shí)可W檢測(cè)大規(guī)模樣品，但必須 依賴于特異性的病毒單抗。本發(fā)明主要針對(duì)南方菜豆花葉病毒單克隆抗體的制備及其檢測(cè) 應(yīng)用展開(kāi)工作，利用雜交瘤技術(shù)制備了 1株能分泌抗SBMV單抗的雜交瘤細(xì)胞19H9,并W其分 泌的單抗為核屯、建立了檢測(cè)該病毒的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑盒，w提高我國(guó)對(duì)南方菜豆花 葉病毒的檢測(cè)水平和速度，防止該病毒自境外傳入國(guó)內(nèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗南方菜豆花葉病毒單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
[0007] 分泌抗南方菜豆花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株19朋，于2016年1月7日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏號(hào)為CGMCC No. 12004,它能分泌 抗南方菜豆花葉病毒的特異性單克隆抗體。
[0008] 一種所述的雜交瘤細(xì)胞株19H9分泌的抗南方菜豆花葉病毒的單克隆抗體，抗南方 菜豆花葉病毒的單克隆抗體腹水間接化ISA效價(jià)達(dá)10-7,抗體類型及亞類為IgGl、kappa輕 鏈。利用ACP-化ISA方法分析發(fā)現(xiàn)，該單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋(w/v，g/ mL)。
[0009] 抗南方菜豆花葉病毒的單克隆抗體僅與感染南方菜豆花葉病毒的病葉組織有特 異性免疫反應(yīng)，而與感染菜豆普通花葉病毒、南方班豆花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉 病毒的病葉組織及健康的大豆、毛豆、班豆、魏豆、蠶豆和菜豆植物組織均不發(fā)生任何免疫 反應(yīng)。
[0010] 抗南方菜豆花葉病毒單克隆抗體在抗南方菜豆花葉病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是W單克 隆抗體為核屯、建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果：1)提供的雜交瘤細(xì)胞株19朋分泌抗南方 菜豆花葉病毒特異性單克隆抗體，W該單抗為核屯、建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫學(xué) 方法及用運(yùn)些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)南方菜豆花葉病毒;2)利用 本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)南方菜豆花葉病毒不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè) 備;3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體可有效地用于口岸及田間作物中的南方菜豆花葉病 毒的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[001 ^ 圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)SBMV的靈敏度分析；
[001引圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)SBMV的特異性分析；
[0014] 1列上下2個(gè)點(diǎn)為2張感染SBMV的菜豆病葉;2列上下2個(gè)點(diǎn)為2張感染菜豆普通花葉 病毒的菜豆病葉；3列上下2個(gè)點(diǎn)為2張健康菜豆葉片;4列上下2個(gè)點(diǎn)為2張健康大豆葉片；5 列上下2個(gè)點(diǎn)為2張健康毛豆葉片;6列上下2個(gè)點(diǎn)分別為感染黃瓜花葉病毒的病葉和健康班 豆葉片；7列上下2個(gè)點(diǎn)分別為感染南方班豆花葉病毒病葉和健康魏豆葉片；8列上下2個(gè)點(diǎn) 分別為感染煙草花葉病毒病葉和健康蠶豆葉片。
[001引圖3是dot-ELISA方法檢ii 口岸豆科植物樣品中SBMV的代表性結(jié)果；
[0016]圖4是RT-PCR方法檢測(cè)口岸豆科植物樣品中SBMV的代表性結(jié)果。
[0017]生物保藏
[001引雜交瘤細(xì)胞株19朋于2016年1月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中屯、，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，保藏號(hào)為CGMCC No.12004。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 分泌抗南方菜豆花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株19朋于2016年1月7日保藏 于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏號(hào)為 CGMCC No. 12004,它能分泌抗南方菜豆花葉病毒的單克隆抗體。
[0020] -種所述的雜交瘤細(xì)胞株19朋分泌的抗南方菜豆花葉病毒的單克隆抗體，抗南方 菜豆花葉病毒的單克隆抗體腹水間接化ISA效價(jià)達(dá)10-7,抗體類型及亞類為IgGl、kappa輕 鏈。利用ACP-化ISA方法分析發(fā)現(xiàn)，該單抗檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81，920倍稀釋(w/v，g/ mL)。
[0021] 抗南方菜豆花葉病毒的單克隆抗體僅與感染南方菜豆花葉病毒的病葉組織有特 異性免疫反應(yīng)，而與感染菜豆普通花葉病毒、南方班豆花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉 病毒的病葉組織及健康的大豆、毛豆、班豆、魏豆、蠶豆和菜豆植物組織均不發(fā)生任何免疫 反應(yīng)。
[0022] 抗南方菜豆花葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是W單克隆抗體為核屯、 建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0023] 本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株19H9能大量分泌抗南方菜豆花葉病毒單抗，且其分泌 的單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。W該單抗為核屯、建立的檢測(cè)SBMV的高通量的血清學(xué)方 法及其檢測(cè)試劑盒可成功應(yīng)用于口岸SBMV的檢測(cè)，從而為提高我國(guó)對(duì)南方菜豆花葉病毒的 檢測(cè)水平，防止該病毒自境外傳入國(guó)內(nèi)提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0024] 下面結(jié)合