一種醛酮還原酶突變體、基因、工程菌及其應(yīng)用
【專利說明】-種酵酬還原酶突變體、基因、工程菌及其應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種阿托伐他汀雙手性中間體的制備方法，特別設(shè)及一種乳酸克魯維 酵母醒酬還原酶突變體和編碼基因、載體、重組工程菌，W及該醒酬還原酶在不對(duì)稱還原6- 氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋制備阿托伐他汀雙手性中間體6-氯基-(3R，5R)-二徑 基己酸叔下醋中的應(yīng)用。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，是阿托伐他汀合成工藝路線中的重要手性 中間體，也是關(guān)鍵的藥效基團(tuán)。由于各國(guó)藥監(jiān)部口對(duì)藥物手性純度設(shè)置嚴(yán)苛的限制(e.e.值 >99.5%，d.e.值>99%) ,6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋的合成技術(shù)成為阿托伐他汀 合成的關(guān)鍵核屯、技術(shù)。傳統(tǒng)的6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋化學(xué)合成工藝從酬酸 (醋）出發(fā)，通過不對(duì)稱合成構(gòu)建手性中屯、，反應(yīng)路線復(fù)雜，需要使用易燃易爆的棚燒、正下 基裡等及深冷等特殊環(huán)境，導(dǎo)致產(chǎn)物d. e.值低、得率低、能耗大。而且，反應(yīng)產(chǎn)生的棚化物廢 物處理困難，需要經(jīng)過繁瑣的反復(fù)甲醇澤滅、真空蒸饋處理。酶具有優(yōu)異的選擇性、反應(yīng)條 件溫和，一般在常溫、常壓及近中性條件下進(jìn)行，把分解、異構(gòu)化、外消旋化、重排等不利副 反應(yīng)降到最低限度，生物催化技術(shù)具備提高過程原子經(jīng)濟(jì)性、實(shí)現(xiàn)過程綠色環(huán)境友好的基 本條件。因此，開發(fā)生物不對(duì)稱還原6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋合成6-氯基- (3R，5R)-二徑基己酸叔下醋技術(shù)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0003] 醒酬還原酶超家族是一類NAD(P化依賴型氧化還原酶，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微 生物細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)，消除環(huán)境中有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的不良影響。目前已發(fā)現(xiàn)的 醒酬還原酶已超過190種，分布于16個(gè)家族。醒酬還原酶通常為約320個(gè)氨基酸組成單亞基 蛋白，大小為34-3化Da,具有(α/β)8筒狀結(jié)構(gòu)，其催化四聯(lián)體由酪氨酸(Tyr)、組氨酸化is)、 天冬氨酸(Asp)和賴氨酸化ys)構(gòu)成，底物作用譜寬，包括脂肪族和芳香組醒和酬、單糖、類 固醇及前列腺素等。目前已有許多醒酬還原酶基因被克隆并在外源宿主中表達(dá)廣泛用于不 對(duì)稱合成手性中間體，其中一些被用于不對(duì)稱還原合成阿托伐他汀中間體6-氯基-(3R, 5R)-二徑基己酸叔下醋。
[0004] 我們已經(jīng)從乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到 的醒酬還原酶K1AKR，并在大腸桿菌化scherichia coli)實(shí)現(xiàn)異源過量表達(dá)化nzyme and Microbial Technology 2015，77:68-77)。該酶能夠催化6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔 下醋不對(duì)稱還原合成6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，產(chǎn)物de值大于99%。但該酶對(duì)6- 氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋的活力并不高，從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。通過已報(bào)道 的醒酬還原酶晶體結(jié)構(gòu)，利用分子模擬手段，確定該酶的空間結(jié)構(gòu)和可能的與活性相關(guān)的 氨基酸位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)提高醒酬還原酶對(duì)6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋 的催化活力，將具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是針對(duì)之前報(bào)道的醒酬還原酶KIAKR對(duì)6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己 酸叔下醋不對(duì)稱還原活性較低的問題，提供一種醒酬還原酶突變體蛋白質(zhì)及其編碼基因， 含有該基因的重組表達(dá)載體和重組工程菌，將表達(dá)該醒酬還原酶突變體的重組工程菌破碎 之后的粗酶液作為催化劑催化6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋的不對(duì)稱還原反應(yīng)， 制備光學(xué)純6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋。與野生型醒酬還原酶相比，本發(fā)明提供的 醒酬還原酶突變體具有更高的催化活性。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種醒酬還原酶突變體，所述醒酬還原酶突變體是將SEQ ID NO. 1所 示氨基酸序列的第295位、第296位進(jìn)行單突變或雙突變獲得的，優(yōu)選所述醒酬還原酶突變 體是將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位進(jìn)行單突變或?qū)Φ?95位和第296位進(jìn)行雙 突變獲得的。
[000引進(jìn)一步，優(yōu)選所述單突變是將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突變 為色氨酸，氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，核巧酸序列為SEQ ID NO.5所示;所述雙突變?yōu)?將SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突變?yōu)樯彼幔⒌?96位色氨酸突變 為亮氨酸，氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示，核巧酸序列為SEQ ID NO.6所示。
[0009] 本發(fā)明使用定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)醒酬還原酶K1AKR編碼基因進(jìn)行突變，連接表達(dá) 載體后轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后再通過高效液相檢測(cè)方法將活性提高的正突變檢 出。獲得的突變體能催化（1~50g/L)6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋不對(duì)稱還原，審U 備光學(xué)純6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋，具體方法如下：來源于K.lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到的醒酬還原酶KlAKR(GenBank accession number :KU145407)由309個(gè)氨 基酸殘基組成，已成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28b-klakr，功能正常的酶蛋白在大腸桿菌化21 (DE3)中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)。然后經(jīng)過同源建模和分子對(duì)接，根據(jù)最優(yōu)構(gòu)象選擇潛在的可能影響 酶活性的位點(diǎn)。設(shè)定定點(diǎn)飽和突變位點(diǎn)，再設(shè)計(jì)并合成適當(dāng)?shù)囊?，W所述的含親本醒酬還 原酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)突變基因的質(zhì)粒。通過將含有全長(zhǎng)突變的質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、篩選出具有高活性的陽性突變子。最后從陽 性突變子中抽提出質(zhì)粒DNA，進(jìn)行DNA測(cè)序分析，W確定引物的突變。在本發(fā)明醒酬還原酶突 變體的制備中，可W采用任何合適的載體。
[0010] 本發(fā)明還提供一種所述醒酬還原酶突變體編碼基因，所述醒酬還原酶突變體編碼 基因構(gòu)建的重組載體及重組基因工程菌，優(yōu)選所述重組質(zhì)粒是祀T28b;所述宿主細(xì)胞是大 腸桿菌E.coli BL2UDE3)。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及醒酬還原酶突變體編碼基因在制備重組醒酬還原酶中的應(yīng)用，所述 應(yīng)用為:構(gòu)建含所述醒酬還原酶突變體基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌(優(yōu) 選大腸桿菌）中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組醒酬還原 酶的菌體細(xì)胞，與野生型醒酬還原酶相比，具有更高的催化活性。
[0012] 本發(fā)明還設(shè)及一種所述醒酬還原酶突變體在制備6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔 下醋中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用W含醒酬還原酶突變體基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的濕菌體為催化劑，W6-氯基-(5R)-徑基-3-幾基己酸叔下醋為底物，W含葡萄糖脫氨 酶基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的葡萄糖脫氨酶濕菌體為輔酶再生酶，W葡萄糖為輔助底 物，W抑7.0、lOOmM憐酸鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，將催化劑和葡萄糖脫氨酶濕菌體用反應(yīng)介 質(zhì)懸浮，超聲破碎，再加入底物和輔助底物，在30°C，200r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲 得6-氯基-(3R，5R)-二徑基己酸叔下醋;所述葡萄糖脫氨酶W含葡萄糖脫氨酶基因的工程 菌化scherichia Co 1 i BL21 (DE3)/pET28b-esg化)發(fā)酵培養(yǎng)獲得濕菌體，具體所述重組基 sibiricum的葡萄糖脫氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì) 粒，并將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌制得的;所述葡萄糖脫氨酶濕菌體用量為10-250g/L緩沖 液(優(yōu)選25g/L)，所述催化劑的用量W濕菌體重量計(jì)為10-250g/L緩沖液(優(yōu)選75g/L)，所述 底物終濃度為1-lOOg/L緩沖液(優(yōu)選50g/L)，所述葡萄糖的終濃度為5-300g/L緩沖液(優(yōu)選 200g/L)。
[0013]進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法制備:將含醒酬還原酶突變體基因的重組工程菌 接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)lOh，再W體積濃度4 %接種 到新鮮的含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體濃度0D6日日為0.6- 0.8，再向培養(yǎng)液中加入終濃度為9g/L的乳糖，28 °C培養(yǎng)1化后，4 °C、8000g離屯、lOmin，收集 菌體細(xì)胞。所述含葡萄糖脫氨酶基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體制備方法同含醒酬還 原酶突變體基因的重組工程菌。進(jìn)一步，所述超聲破碎條件為:冰浴置于超聲破碎儀中，W 400W功率破碎20min，破Is停Is。
[0014]本發(fā)明所述葡萄糖脫氨酶濕菌體制備方法為：將來源于Exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脫氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì) 粒，并將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Escherichia Coli BL2UDE3)獲得含葡萄糖脫氨酶基因 的重組基因工程菌;將含葡萄糖脫氨酶基因的重組工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉素 的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)lOh，再W體積濃度4 %接種到新鮮的含終濃度50mg/L卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.6-0.8,再向培養(yǎng)液中加入終濃度為 9g/L的乳糖，28 °C培養(yǎng)1化后，4°C、8000g離屯、1 Omin，收集菌體細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明所述的醒酬還原酶突變體可工程菌全細(xì)胞形式使用，也可