山楂果實矢車菊素-3-羥基糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及山植果實矢車菊素-3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶 及其編碼基因與應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花色巧屬于黃酬類物質(zhì)，是廣泛分布于自然界的一種水溶性植物色素，具有抗氧 化、抗突變、抗腫瘤、防治屯、血管疾病等多種生物活性。前期研究表明，山植果實中花色巧類 成分主要為矢車菊素 3-0-β-半乳糖巧和矢車菊素-3-0-α-阿拉伯糖巧兩種花色巧，并通過 化學分離的手段分離得到其單體化合物。由于花色巧的不穩(wěn)定性，給化學分離造成了困難， 導致花色巧標準品市場售價極高;有些種類的花色巧由于在植物中含量極低，無法通過化 學分離的手段得到。生物合成技術(shù)為大量獲得有效成分提供了新的思路，近年來，有關(guān)花色 巧生物合成與調(diào)控機制的研究已在玉米、擬南芥、葡萄、蘋果等植物中取得了進展。
[0003] 矢車菊素-3-0-半乳糖巧轉(zhuǎn)移酶催化矢車菊素與UDP-D-半乳糖生成矢車菊素-3- 0-半乳糖巧，是矢車菊素-3-0-半乳糖巧生物合成下游的關(guān)鍵酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供山植果實矢車菊素-3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白，命名為Cp30GT，是如下1)或2):
[0006] 1)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0007] 2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[000引上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009]編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。
[0010] 上述DNA分子是如下1 )-4)中任一種的DNA分子：
[oow 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[0012] 2)編碼區(qū)為序列表中序列1第27-1475位所示的DNA分子；
[001引3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA 分子；
[0014] 4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96%、至少具有97 %、至少具有98%或至少 具有99 %同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[001引上述嚴格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0016]含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的 范圍。
[0017] 重組載體為將序列表中序列1所示的Cp30GT基因插入祀T28a載體的BamHI酶切位 點間得到的載體，命名為祀T28a-Cp30GT。
[0018] 擴增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。
[0019] 引物對為上游引物 P3:5 ' GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCACCGCCGCAGCCCACCG 3'（序列3)和下游引物P4:5'TGTCGACGGAGCTCGAATTCCTATGCTTTATTGGATCCTGAT 3'（序列4)。
[0020] 上述蛋白在作為矢車菊素-3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0021] 上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備矢車菊素- 3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0022] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在催化 矢車菊素與UDP-D-半乳糖生成矢車菊素-3-0-半乳糖巧中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0023] 本發(fā)明另一個目的是提供一種制備矢車菊素-3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。
[0024] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:培養(yǎng)上述重組菌，收集培養(yǎng)物，得到矢車菊素- 3-徑基糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0025] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明首次從山植果實中克隆得到山植果實矢車菊素-3-0- 半乳糖巧轉(zhuǎn)移酶(Cp30GT)基因，體外實驗表明，Cp30GT具有催化矢車菊素和UDP-D-半乳糖 生成矢車菊素-3-0-半乳糖巧的活性。利用本發(fā)明可W通過基因工程技術(shù)來提高山植等植 物中矢車菊素-3-0-半乳糖巧等花色巧類成分的含量，或通過生物合成技術(shù)制備矢車菊素- 3-0-半乳糖巧等花色巧類成分。
【附圖說明】
[00%] 圖1為重組表達載體祀T28a-Cp30GT的圖譜。
[0027] 圖2為Cp30GT蛋白質(zhì)的SDS-聚丙締酷胺凝膠電泳結(jié)果。
【具體實施方式】
[0028] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] W下的實施例便于更好的理解本發(fā)明，運些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限 制本發(fā)明的范圍。
[0031] 在下述實施例中使用的試驗方法中，未注明具體條件的實驗方法，均為本領(lǐng)域技 術(shù)人員的公知常識，各種緩沖溶液，檢測試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得或者 由常規(guī)實驗方法制備獲得。
[0032] 試驗中使用試劑如同源重組克隆試劑盒（pEASY-加 i Seamless Cloning and Assembly Kit)、蛋白Marker、大腸桿菌感受態(tài)TransTl和I3L21DE3、祀T28a載體W及DNA凝膠 回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技（北 京）有限公司公司，BamH I限制性內(nèi)切酶購自紐英倫(NEB)生物技術(shù)北京有限公司，其他常 用試劑購自寶生物(大連)工程有限公司（TaKaRa)公司。引物合成和測序由北京眷博興科生 物技術(shù)有限公司完成。
[0033] 下面通過實例進一步詳細描述本發(fā)明。
[0034] 實施例1、矢車菊素-3-0-半乳糖巧轉(zhuǎn)移酶基因 Cp30GT的克隆
[00對利用改良CTAB法分別提取山植果實的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用正向引物 P1:5'ATGGCACCGCCGCAGCCCACCG 3'，反向引物P2:5'CTATGCTTTATTGGATCCTGAT 3'進行PCR 擴增，得到的1.4化PCR產(chǎn)物。
[0036] 上述擴增體系（lOyL)如下：5XPS GXLBuffer 2^，(1ΝΤΡ3(2.5πιπιο1 · kl)0.祉L， 引物PI和P2各0.化L，Prime STAR GXL 0.化L，模板化L，其余用無菌雙蒸水補足。反應條件： 98°C 預變性 3111111;98°(：1〇3,55°(：退火153,68°(：延伸11111113〇3,40個循環(huán);68°(：延伸5111111，41： 保存。
[0037] 經(jīng)過測序，1.地b PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核巧酸，開放閱讀框為序列1 第27-1475位核巧酸所示的基因命名為Cp30GT，編碼的蛋白命名為Cp30GT，該蛋白的氨基酸 序列為序列表中序列2。
[0038] 實施例2、矢車菊素-3-0-半乳糖巧轉(zhuǎn)移酶基因 Cp30GT的功能研究
[0039] 1、重組載體的制備
[0040] 提取山植果實的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用如下引物：
[0041 ]上游引物P3:5'GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCACCGCCGCAGCCCACCG 3'（序列 3)和下游引物口4:5'了61^64〔6646(：1^644170：了4了6(：1'7^刊664了0：了64了3'（序列4)，進行口0? 擴增反應。
[0042] PCR反應體系（lOOyL)為：5XPS G)(LBuffer 20yL，dNTPs