提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修飾ahcy蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質的免疫原性技術領域，具體涉及一種提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修飾ahcy蛋白。
【背景技術】
[0002]S-腺昔-L-半耽氛酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，ahcy)是布魯氏菌免疫原性蛋白，是預防布魯氏菌的亞單位疫苗的候選抗原，對布魯氏菌具有較好的免疫保護。
[0003]布魯氏菌屬于胞內寄生菌，目前還沒有理想的治療手段和藥物，疫苗預防是防控該病的唯一有效手段。布魯氏菌的免疫機制目前還沒有完全清楚，但是無論是體液免疫反應還是細胞免疫反應對布魯氏菌的清除都是起作用的，但是細胞免疫反應是排除胞內寄生菌最主要的免疫機制。布魯氏菌活的弱毒疫苗以及一些保護性抗原配合佐劑都能夠誘導很強的細胞免疫反應。目前布魯菌病疫苗的種類較多，世界大約有200多種布魯氏菌疫苗，主要包括弱毒活菌苗，滅活疫苗，突變株疫苗，基因工程苗和抗獨特型抗體苗等。由于一些弱毒疫苗，滅活疫苗都存在著一些缺陷以及一些新疫苗的研制又都處于實驗室階段，致使目前還沒有更加理想的布魯氏菌疫苗用于控制人畜布病。所以當前布魯氏菌疫苗的研究也主要集中在篩選弱毒株，構建突變株以及尋找亞單位疫苗等方面。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了給布魯氏菌提供更好的疫苗候選抗原，提供一種提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修飾ahcy蛋白。
[0005]本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下:
[0006]本發(fā)明的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一、4°C下，將六糖與高碘酸鈉按摩爾比為1:1的比例混合，在pH 6.0的I3BS中反應Ih;
[0008]步驟二、室溫下，按EDC與NHS的摩爾比為1:1的比例，向步驟一所得反應體系中加入EDC和NHS，反應6h;
[0009]步驟三、室溫下，按ahcy蛋白與六糖的摩爾比為1:1000的比例，向步驟二所得反應體系中加入ahcy蛋白，過夜反應；
[0010]步驟四、4°C下，在50mmol/L、pH8.0?9.6的碳酸鹽溶液中透析511;
[0011]步驟五、4°(:下，在50臟01/1^!17.0?8.0的？85中透析一天。
[0012]進一步的，所述ahcy蛋白通過以下方法制備:
[0013]步驟一、將大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)制備成感受態(tài)細胞后，轉化重組質粒pET28a_ahcy 構建 pET-28a_ahcy/BL21 表達菌株，pET-28a_ahcy/BL21 表達菌株用終濃度lmmol/L的IPTG誘導6h表達蛋白；
[0014]步驟二、離心收集E.coli BL21細胞，用PBS洗滌2次，5000rmp/min，離心15min，收集菌液；
[0015]步驟三、加入冰預冷的50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl和2mmol/L的EDTA，洗滌菌液一次，所加入的Tris-HCl和EDTA的總體積為菌液體積的1/5;
[0016]步驟四、離心收集菌液，重懸于冰預冷的10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl中，Tris-HCl的體積為菌液體積的1/10，加入溶菌酶至0.lmg/ml，再加入I %的Triton X-100，37 °C孵育15min；
[0017]步驟五、加入終濃度為lmmol/L的PMSF，置冰浴中超聲裂解菌體，超聲lOsec，間歇1sec，最大功率300W、超聲30min，超聲破碎直至溶液不再粘稠且呈現(xiàn)透明狀態(tài)；
[00? 8] 步驟六、12000rpm，4 °C離心30min，取離心上清液用0.45μηι濾膜過濾，對過濾后的上清液進行SDS-PAGE驗證分析，結果目的蛋白大小為55KD，與預期大小相同。
[0019]步驟七、His Trap FF親合層析柱純化目的蛋白:
[0020](I) 5個柱體積的餾水洗滌柱；
[0021 ] (2)5個柱體積的Elut1n buffer洗滌柱；
[0022](3)5個柱體積的餾水洗滌柱；
[0023](4) 10個柱體積的Binding buffer平衡柱；
[0024](5)上樣，過柱，要注意液體過柱的流速，控制在lml/min;
[0025](6)5個柱體積的Binding buffer洗脫雜蛋白；
[0026](7)5?10個柱體積的Elut1n buffer洗脫目的蛋白，并回收至新的EP管里，對純化后的ahcy蛋白進行SDS-PAGE驗證分析，結果純化后的目的蛋白大小為55KD，與預期大小相同。
[0027]通過上述的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法獲得的六糖修飾ahcy蛋白，其刺激增殖指數(shù)IS是ahcy蛋白的2.77倍，抗體效價IgG較ahcy蛋白在4?5周時提高I倍，刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IFN- γ的量是ahcy蛋白的6.86倍，刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
[0028]本發(fā)明的有益效果是:
[0029]本發(fā)明提供了一種提高ahcy蛋白免疫原性的方法，是一種布魯氏菌提供新的亞單位疫苗的制備方法，進一步提高該蛋白誘導細胞免疫和體液免疫水平。本發(fā)明使用化學合成方法對ahcy蛋白進行甘露寡糖修飾，實驗找出穩(wěn)定的寡糖修飾方法，得到的糖蛋白免疫小鼠檢測小鼠脾細胞淋巴細胞增殖、血清中抗體消長、脾細胞原代培養(yǎng)液中細胞因子的含量，篩選出對蛋白免疫原性改變較大的寡糖修飾蛋白。
[0030]ahcy蛋白、六糖修飾蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴細胞的IS(刺激增殖指數(shù))分別為1.63和4.52，六糖修飾蛋白(ahcymhe)的IS是ahcy蛋白的2.77倍。
[0031 ] ahcy蛋白、六糖修飾蛋白(ahcymhe)的抗體效價IgG分別為1:64000和1:128000，六糖修飾蛋白(ahcymhe)抗體效價IgG較ahcy蛋白在4?5周時提高I倍。
[0032]ahcy蛋白、六糖修飾蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IFN-γ的量分別為902.27pg/ml和6192.045pg/ml，六糖修飾蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IFN-γ的量是ahcy蛋白的6.86倍。
[0033]ahcy蛋白、六糖修飾蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IL_2的量分別為43.23pg/ml和166.76pg/ml，六糖修飾蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴細胞后產(chǎn)生細胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
【附圖說明】
[0034]圖1為ahcy蛋白誘導表達的SDS-PAGE結果。圖中:泳道I為未誘導的pET-28a_ahcy/BL21細胞裂解液;泳道2為誘導的pET-28a-ahcy/BL21細胞裂解液;泳道3為誘導的pET_28a-ahcy/BL21細胞裂解液上清;泳道4為誘導的pET-28a_ahCy/BL21細胞裂解液沉淀；泳道5為誘導的pET-28a-ahcy/BL21細胞裂解液上清；泳道6為誘導的pET-28a-ahcy/BL21細胞裂解液沉淀。
[0035]圖2為純化的ahcy蛋白的SDS-PAGE結果。圖中:泳道I為誘導的pET-28a_ahcy/BL21細胞裂解液;泳道2和泳道3均為純化后洗脫的ahcy蛋白。
[0036]圖3為小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結果。圖中:ahcym表示單糖修飾ahcy蛋白，ahcymbi表示二糖修飾ahcy蛋白，ahcymtr表示三糖修飾ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修飾ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修飾ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修飾ahcy蛋白。
[0037]圖4為免疫小鼠后測定小鼠抗體效價增長曲線。圖中:ahcymbi表示二糖修飾ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修飾ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修飾ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修飾ahcy蛋白。
[0038]圖5為細胞因子INF-γ含量檢測結果。圖中:ahcymbi表示二糖修飾ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修飾ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修飾ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修飾ahcy蛋白ο
[0039]圖6為細胞因子IL-2含量檢測結果。圖中:ahcymbi表示二糖修飾ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修飾ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修飾ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修飾ahcy蛋白ο
[0040]圖7為細胞因子IL-10含量檢測結果。圖中:ahcymbi表示二糖修飾ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修飾ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修飾ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修飾ahcy蛋白ο
【具體實施方式】
[0041]下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0042]實施例1ahcy蛋白的制備及純化
[0043]l、ahcy蛋白的制備
[0044](I)將大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)制備成感受態(tài)細胞后，轉化重組質粒pET28a_ahcy 構建 pET-28a_ahcy/BL21 表達菌株，pET-28a_ahcy/BL21 表達菌株用終濃度lmmol/L的IPTG誘導6h表達蛋白；
[0045](2)離心收集E.coli BL21細胞，用PBS洗滌2次，5000rmp/min，離心15min，收集菌液；
[0046](3)加入冰預冷的 50mmol/L 的 Tris-HCl (pH8.0)和 2mmol/L 的 EDTA，洗滌菌液一次，所加入的Tr i s-HCl和EDTA的總體積為菌液體積的I /5;
[0047](4)離心收集菌液，重懸于冰預冷的1mmoI/L的Tris-HCl(pH8.0)中，Tris-HCl的體積為菌液體積的1/10，加入溶菌酶至0.lmg/ml，再加入I %的Tri ton X-100，37 °C孵育15min；
[0048](5)加入終濃度為lmmol/L的PMSF，置冰浴中超聲裂解菌體，超聲lOsec，間歇1sec，最大功率300W、超聲30min，超聲破碎直至溶液不再粘稠且呈現(xiàn)透明狀態(tài)；
[0049](6)12000rpm，4°C離心30min，取離心上清液用0.45μπι濾膜過濾，過濾后上清液經(jīng)SDS-PAGE驗證后用于目的蛋白純化。
[0050]ahcy蛋白經(jīng)SDS-PAGE驗證分析后的結果如圖1所示，目的蛋白大小為55KD，與預期大小相同。
[0051]2、His Trap FF親合層析柱純化目的蛋白
[0052](I) 5個柱體積的餾水洗滌柱；
[0053](2)5個柱體積的Elut1n buffer洗滌柱；
[0054](3)5個柱體積的餾水洗滌柱；
[0055](4) 10個柱體積的Binding buffer平衡柱；
[0056](5)