簡單、靈敏檢測核酸外切酶iii活性的探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶活性的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種簡單、靈敏度檢測核酸外切酶 III活性的探針，W及該探針在核酸外切酶ΙΠ 活性檢測和抑制劑篩選中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸外切酶III屬于DNA水解酶，能夠沿雙鏈DNA的3 ' ^5 '方向逐步催化去除單核 巧酸。許多重要的生物過程都與核酸外切酶III的活性有關(guān)。例如，保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性、 促進(jìn)基因重組的順利進(jìn)行、修復(fù)雙鏈DNA的損壞等。同時，核酸外切酶ΙΠ 也被廣泛地應(yīng)用于 信號放大檢測技術(shù)中，W實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的高靈敏度檢測。因此，對核酸外切酶III活性 的檢測不僅有助于疾病的診斷治療及藥物的研制開發(fā)，而且有利于將核酸外切酶III更好 地應(yīng)用到生物分析檢測中。
[0003] 傳統(tǒng)的檢測核酸外切酶III活性的方法是基于放射性同位素標(biāo)記的DNA探針并結(jié) 合凝膠電泳的方法。然而，運些檢測技術(shù)通常是不連續(xù)的，成本高，操作繁瑣且耗時，還需要 嚴(yán)格的安全措施防止曝光過量。近年來，人們相繼報道了利用巧光法檢測核酸外切酶ΠΙ的 活性來替代傳統(tǒng)的檢測方法。例如，Zhao等報道了一種利用雙標(biāo)記分子信標(biāo)巧光法快速檢 測核酸外切酶ΠΙ的活性(Analyst ,2014,139,1081-1087) DMin等基于氧化石墨締和單標(biāo)記 核酸探針構(gòu)建了一種巧光生物傳感器用于核酸外切酶III的活性檢測及抑制劑的篩選 (Analyst ,2012,137,2024-2026) eLeung等提出了一種基于G-四聚體無標(biāo)記巧光法檢測核 酸外切酶III的活性(Methods，2013,64,218-223)。511等設(shè)計的分子信標(biāo)利用3'端富含的0 堿基與相對的5'端標(biāo)的巧光素相互作用來對核酸外切酶III進(jìn)行實時檢測，檢出限為 0.04U/mL(Anal. Chem.，2012，84，5059-5065)。然而上述報道的運些方法都存在一些缺點， 如反應(yīng)時間過長，需要對核酸探針進(jìn)行巧光基團(tuán)W及巧滅基團(tuán)的雙標(biāo)記或者需要外加巧滅 材料，靈敏度低、選擇性差等，大大地增加了實驗體系的復(fù)雜性W及成本，從而限制了檢測 方法的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有檢測核酸外切酶ΙΠ 活性的方法存在的 問題，提供一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移巧光法簡單、靈敏檢測核酸外切酶III活性及的探針， W及該探針在核酸外切酶ΠΙ活性檢測和抑制劑篩選中的應(yīng)用。
[0005] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:該探針是從5'端到3'端由3~6個重復(fù)的 CG堿基序列構(gòu)成的DNA，優(yōu)選從5 '端到3 '端由4個重復(fù)的CG堿基序列構(gòu)成的DNA，且3 '端標(biāo)記 巧光基團(tuán)。
[0006] 上述巧光基團(tuán)為6-簇基巧光素、簇基四甲基羅丹明、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-簇 基巧光素、四氯-6-簇基巧光素、六氯-6-甲基巧光素、德克薩斯紅、3H-嗎I噪菁染料、7-氨基- 4-甲基香豆素、二乙胺基香豆素、糞并巧光素中的任意一種。
[0007] 本發(fā)明探針在檢測核酸外切酶ΙΠ 活性中的應(yīng)用，具體檢測方法由下述步驟組成：
[000引 1、將探針溶解于含有5臟ol/L Mgh和5(kmol/L化+的pH值為7.4的化is-HCl緩沖 溶液中，使化is-HCl緩沖溶液中探針的濃度為IxlO-Vol/L，然后將其在90°C保溫10分鐘，再 自然降溫至室溫并解育30分鐘，得到雜交后的探針。
[0009] 2、用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L化+的抑值為7.4的化is-HCl緩沖溶液將雜交 后的探針稀釋至濃度為0.1~lOymol/L，然后加入不同活性的核酸外切酶III，在37°C下解 育10~50分鐘，用巧光光譜儀檢測不同活性下核酸外切酶ΙΠ 對應(yīng)的巧光強(qiáng)度，繪制巧光強(qiáng) 度隨核酸外切酶ΠI活性變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0010] 3、按照步驟2的方法檢測待測樣品的巧光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可確 定待測樣品中核酸外切酶ΠI的活性。
[0011] 上述步驟2中，優(yōu)選用化is-HCl緩沖溶液將雜交后的探針稀釋至濃度為0.2皿〇1/ L，然后加入不同活性的核酸外切酶III，在37°C下解育40分鐘，用巧光光譜儀檢測不同活性 下核酸外切酶ΠI對應(yīng)的巧光強(qiáng)度，繪制巧光強(qiáng)度隨核酸外切酶ΠI活性變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 本發(fā)明探針在核酸外切酶III抑制劑篩選中的應(yīng)用，具體檢測方法為：向60化濃度 為0.2ymol/L雜交后的探針中加入30化活性為抓/mL核酸外切酶III和30化不同的抑制劑， 在37°C下解育40分鐘，其中核酸外切酶ΙΠ 和抑制劑均用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L Na+ 的20mmol/L pH值為7.4的化is-HCl緩沖溶液配制成溶液;然后用巧光光譜儀檢測不同抑制 劑對應(yīng)體系的巧光強(qiáng)度，巧光強(qiáng)度越小，說明抑制劑對核酸外切酶ΠΙ的抑制效果越強(qiáng)。
[0013 ]本發(fā)明利用核酸外切酶ΠI能沿雙鏈DNA的3 ' ^5 '方向逐步催化去除單核巧酸，但 是對單鏈DNA或者單核巧酸不起作用的原理，設(shè)計合成了一種結(jié)構(gòu)簡單的探針，該探針在緩 沖溶液中能自組裝成為雙鏈DNA，G堿基與巧光基團(tuán)之間發(fā)生光電子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移，使巧光被焰 滅，當(dāng)檢測體系中含有核酸外切酶ΠΙ時，核酸外切酶ΙΠ 沿著探針的3 '端作用，使巧光基團(tuán) 和DNA分離開游離在溶液中，巧光基團(tuán)的巧光得W恢復(fù)，通過檢測體系的巧光強(qiáng)度即可實現(xiàn) 核酸外切酶III活性的定量檢測。采用本發(fā)明探針檢測核酸外切酶III活性的方法簡單、快 捷、選擇性好、靈敏度高，檢出限可達(dá)到5Xl(T4U/mL。本發(fā)明探針還可用于核酸外切酶ΙΠ 抑 制劑的篩選。
【附圖說明】
[0014] 圖1是不同活性核酸外切酶ΙΠ 對應(yīng)體系的巧光發(fā)射光譜。
[0015] 圖2是活性為5 X 10-4~1 X l(TiU/mL的核酸外切酶ΙΠ 對應(yīng)體系的巧光強(qiáng)度變化曲 線。
[0016] 圖3是活性為1 X 1〇-1~抓/血的核酸外切酶ΙΠ 對應(yīng)體系的巧光強(qiáng)度變化曲線。 [0017]圖4是不同濃度金精Ξ簇酸對核酸外切酶III活性的影響。
[0018] 圖5是基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理檢測核酸外切酶ΙΠ 的原理驗證圖。
[0019] 圖6是雜交后的探針長度對檢測體系的影響。
[0020] 圖7是雜交后的探針濃度對檢測體系的影響。
[0021] 圖8是雜交后的探針和核酸外切酶ΙΠ 作用時間對檢測體系的影響。
[0022] 圖9是雜交后的探針對不同酶的選擇性檢測結(jié)果。
[0023] 圖10是雜交后的探針對細(xì)胞裂解緩沖液(a)、海拉細(xì)胞裂解液(b)、海拉細(xì)胞裂解 液與抑制劑ATA( C)的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 運些實施例。
[0025] 實施例1
[0026] 本實施例中檢測核酸外切酶ΙΠ 活性的探針是堿基序列為5'-CGCGCGCG-3'的DNA， 且3'端用6-簇基巧光素(FAM)標(biāo)記，由生工生物工程有限公司合成。
[0027] 上述探針在檢測核酸外切酶ΙΠ 活性中的應(yīng)用，檢測方法由下述步驟組成：
[0028] l、將探針溶解于含有5mmol/LMg2+和50mmol/LNa+的20mmol/LpH值為7.4的 Tris-HCl緩沖溶液中，使Tris-肥1緩沖溶液中探針的濃度為lxl〇-4mol/L，然后將其在90°C 保溫10分鐘，再自然降溫至室溫并解育30分鐘，得到雜交后的探針。
[00巧]2、用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L 化+ 的20mmol/L pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶 液將雜交后的探針稀釋至濃度為0.2μπιο1/1;向60化濃度為0.2皿ol/L雜交后的探針中分別 加入 60化活性為 5X1〇-4、1X1〇-3、2X1〇-3、5X1〇-3、1X1〇-2、2X1〇-2、5X1〇-2、1X1〇-i、2X l〇-i、5Xl〇-i、l、2、抓/mL核酸外切酶III(購自寶生物工程(大連)有限公司，用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L Na+的20mmol/L pH值為7.4的Tris-肥1緩沖溶液配制成溶液），在37°C下解 育40分鐘，用化-4600型巧光分光光度計在最大激發(fā)波長為490nm、發(fā)射波長為518nm處檢測 不同活性下核酸外切酶ΠΙ對應(yīng)的巧光強(qiáng)度(激發(fā)狹縫為lOnm，發(fā)射狹縫為lOnm)，結(jié)果見圖 1，并繪制巧光強(qiáng)度隨核酸外切酶ΠΙ活性變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2~3。
[0030] 如圖1所示，隨著核酸外切酶III的活性逐漸增大，體系的巧光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；由圖 2~柯見，犧X 1〇-4~5U/mL活性范圍內(nèi)，體系的巧光強(qiáng)度與核酸外切酶III的活性呈線性 關(guān)系，其中核酸外切酶III活性為5X 10-4~1 X l(TiU/mL時，巧光強(qiáng)度與核酸外切酶III活性 變化的線性方程為F = 76.76+6322.75C，核酸外切酶ΠI活性為1 X 1〇-1~抓/mL時，巧光強(qiáng)度 與核酸外切酶III活性變化的線性方程為F = 694.16巧9.75C，式中F為體系的巧光強(qiáng)度，C為 核酸外切