泳檢測(cè)，W雜交種與親本恢復(fù)系和雜交種與親本保持系作為對(duì)照，根據(jù)雜合帶型與親本帶 型的區(qū)別，即可將雜交種和非雜交種的數(shù)量統(tǒng)計(jì)出來。按照統(tǒng)計(jì)出來的數(shù)量計(jì)算雜交小麥 種子純度會(huì)與實(shí)際純度有一定的誤差，因此，本實(shí)施例中將統(tǒng)計(jì)的檢測(cè)值與設(shè)計(jì)的理論值 進(jìn)行回歸分析，得到檢測(cè)值與理論值之間的方程，將檢測(cè)值代入上述方程得到的純度更加 接近實(shí)際純度。
[0052] 作為上述實(shí)施例的優(yōu)選，Ξ系雜交小麥種子分別與恢復(fù)系和保持系種子按不同的 設(shè)計(jì)比例混合形成多個(gè)試驗(yàn)組。Ξ系雜交小麥種與恢復(fù)系按不同的設(shè)計(jì)比例混合形成多個(gè) 試驗(yàn)組，待發(fā)苗后提取DNA;然后分別用兩組引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙締酷胺凝 膠電泳染色檢測(cè)，分別回歸得到相應(yīng)的方程。Ξ系雜交小麥種與保持系按不同的設(shè)計(jì)比例 混合形成多個(gè)試驗(yàn)組，待發(fā)苗后提取DNA;然后分別用兩組引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增聚 丙締酷胺凝膠電泳染色檢測(cè)，分別回歸得到相應(yīng)的方程。
[0053] 本發(fā)明實(shí)施例中，WAL型Ξ系雜交小麥新冬43號(hào)(新農(nóng)審字2013第5號(hào)）的親本不 育系(AL18A)和恢復(fù)系(99AR144-1)為材料。抽取純度100%的雜交小麥新冬43號(hào)種子1400 粒，等分成14份，每份100粒。其中7份人為混合恢復(fù)系種子，見表1，另外7份人為混合保持系 種子，見表2。不同種子純度比例設(shè)計(jì)如下：100% ,97% ,94% ,91% ,88% ,85%和82%。具體 方法是將100粒種子分別按表1和表2比例充分混勻后，擺成圓形，采用四分法用直尺將其 分成均勻的四等份，每份種子量為25粒，隨機(jī)選取1份按單粒在穴盤上發(fā)苗，然后提取葉片 DNA。
[0054] 表1:人為混入恢復(fù)系試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
[0化5]
[0056]~表2:人為混入保持系試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
[0化7]________
[0058] 按照上述方法擴(kuò)增和聚丙締酷胺凝膠電泳染色檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)得到的恢復(fù)系檢測(cè)值X 見表3,設(shè)計(jì)的純度及恢復(fù)系的設(shè)計(jì)的理論值及回歸得到的恢復(fù)系的小麥雜交種純度理論 值y與檢測(cè)值X的方程見表3。
[0059] 按照上述方法擴(kuò)增和聚丙締酷胺凝膠電泳染色檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)得到的保持系檢測(cè)值X 見表4,設(shè)計(jì)的純度及保持系的設(shè)計(jì)的理論值及回歸得到的保持系的小麥雜交種純度理論 值y與檢測(cè)值X的方程見表4。
[0060] 表3:雜交種混雜不同比例恢復(fù)系種子分子標(biāo)記純度分析(25粒）
[0061]
[0063] 表4:雜交種混雜不同比例保持系種子分子標(biāo)記純度分析(25粒）
[0064]
[0065] 上述4個(gè)回歸方程相關(guān)系數(shù)均>0.9相關(guān)極顯著，表明建立的4個(gè)回歸方程在人為 混入非雜交種純度鑒別中均可使用。
[0066] 上述實(shí)施例中是針對(duì)混入的非雜交種粒數(shù)進(jìn)行修正，回歸得到非雜交種的小麥雜 交種純度理論值與檢測(cè)值的方程。當(dāng)然，本發(fā)明實(shí)施例的小麥雜交種純度理論值與檢測(cè)值 的方程，不僅指上述實(shí)施例的非雜交種數(shù)量的檢測(cè)值與理論值的方程，還可W是雜交種數(shù) 量的檢測(cè)值與計(jì)算值的方程或者直接是雜交種純度的測(cè)量值(根據(jù)測(cè)量結(jié)果直接得到的純 度值)與計(jì)算值的方程。
[0067] 下面按不同比例混合，分別檢測(cè)驗(yàn)證。
[0068] Xwmc474(2A)對(duì)混雜恢復(fù)系和保持系種子純度檢測(cè)
[0069] 100粒種子97%為新冬43號(hào)雜種種子，3%為恢復(fù)系種子進(jìn)行充分的混合，從中隨 機(jī)選取25粒種子進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測(cè)。圖1為混雜恢復(fù)系種子雜種純度97%檢測(cè)圖。圖中 Μ為Marker, 1為新冬43號(hào)雜交種，2為99AR144-1恢復(fù)系，3-27為檢測(cè)種子，從圖中可W看出 僅有序號(hào)23顯示恢復(fù)系條帶，其余24個(gè)都顯示雜合帶。將x = 1代入方程y = 4. r^+0.7875X (表3)，計(jì)算純度為96.8%。
[0070] 100粒種子94%為新冬43號(hào)雜種種子，6%為保持系種子進(jìn)行充分混合，從中隨機(jī) 選取25粒種子進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測(cè)。圖2為混雜保持系種子雜種純度94%檢測(cè)圖。圖中Μ 為Marker, 1為新冬43號(hào)雜交種，2為18Β保持系，3-27為檢測(cè)種子，從圖2中可W看出與保持 系相同的條帶為序號(hào)15、21共計(jì)2個(gè)，其余23個(gè)都顯示雜種帶。將x = 2代入方程y = 0.2109+ 0.6797^(表4)，計(jì)算純度為93.7%。
[0071] Xbarc8( 1B)對(duì)混雜恢復(fù)系和保持系種子純度檢測(cè)
[0072] 100粒種子85%為新冬43號(hào)雜種種子，15%為恢復(fù)系種子進(jìn)行充分混合，從中隨機(jī) 選取25粒種子進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測(cè)。圖3為混雜恢復(fù)系種子雜種純度85%檢測(cè)圖。圖中Μ 為Marker，1為新冬43號(hào)雜交種，2為99AR144-1恢復(fù)系，3-27為檢測(cè)種子，從圖中可W看出與 恢復(fù)系相同的條帶為序號(hào)4、6、7、17共計(jì)4個(gè)，其余21個(gè)都顯示雜種帶。將x = 4代入方程y = - 0.145化0.9314x(表3)，計(jì)算純度為85.7%。
[0073] 100粒種子82%為新冬43號(hào)雜種種子，18%為保持系種子進(jìn)行充分混合，從中隨機(jī) 選取25粒種子進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測(cè)。圖4為混雜保持系種子雜種純度82 %檢測(cè)圖。圖中Μ 為Marker, 1為新冬43號(hào)雜交種，2為18Β保持系，3-27為檢測(cè)種子，從圖中可W看出與保持系 相同的條帶為序號(hào)4、18、19、22、26、27共計(jì)6個(gè)，其余19個(gè)都顯示雜種帶。將^ = 6代入方程7 =0.4083+0.7583x(表4)，計(jì)算純度為80.2%。
[0074] 下面實(shí)際應(yīng)用對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的效果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0075] 在隔離區(qū)，不育系41^364與恢復(fù)系9941?144-巧巾子按85%:15%比例混合播種。從播 種收獲的種子中分別抽取1000粒種子，再用四分法隨機(jī)取25粒種子發(fā)苗，提取葉片DNA，然 后利用引物XbarcS進(jìn)行檢測(cè)，得出小麥雜交種純度檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果參見附圖5,檢測(cè)出 與恢復(fù)系相同的條帶有4、13和24共3個(gè)，顯雜合帶有22個(gè)。將檢測(cè)結(jié)果x = 3代入表3引物 XbarcS純度檢測(cè)回歸方程y = -0.145化0.9314x，y = 2.65，1 - (2.65今 25) X 100得到89.4% 檢測(cè)純度與理論純度88% (參見表3、4中非雜交種檢測(cè)個(gè)數(shù)與對(duì)應(yīng)的理論純度)結(jié)果高度一 致。
[0076] 在隔離區(qū)，不育系A(chǔ)L36A與恢復(fù)系99AR144-1種子按行比5:1播種。僅收獲母本不育 系所結(jié)雜交種子，從中抽取1000粒種子，再用四分法隨機(jī)取25粒種子發(fā)苗，提取葉片DNA，然 后利用引物Xwmc474進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見附圖6,25個(gè)均顯雜合帶，得出小麥雜交種純度為 100%的檢測(cè)結(jié)果。
[0077] 從而驗(yàn)證小麥雜交種純度檢驗(yàn)方程在大田生產(chǎn)小麥雜交種純度檢驗(yàn)的可靠性。
[0078] W上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何 熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)W所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 三系雜交小麥種子純度分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為SSR分子標(biāo)記，其特征在于，所述 分子標(biāo)記為位于2A染色體上的Wmc474或位于1B染色體上的Barc8。2. 權(quán)利要求1所述的三系雜交小麥種子純度分子標(biāo)記的引物對(duì)，其中 位于2A染色體上的Wmc474的引物對(duì)的序列如下： Xwmc474L:ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG， Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA； 位于1B染色體上的Barc8的引物對(duì)的序列如下： Xbarc8L：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA, Xbarc8R:GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。3. 權(quán)利要求1所述的三系雜交小麥種子純度分子標(biāo)記在AL型三系雜交小麥種子純度檢 測(cè)中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟： 將三系雜交小麥種與非雜交種按不同的設(shè)計(jì)比例混合形成多個(gè)試驗(yàn)組，待發(fā)苗后提取 DNA； 用所述SSR分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物對(duì)幼苗DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳染色檢 測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組的雜交種和非雜交種的檢測(cè)數(shù)量； 將統(tǒng)計(jì)出的檢測(cè)值與設(shè)計(jì)的理論值作相關(guān)性分析和回歸分析得到小麥雜交種純度計(jì) 算值與檢測(cè)值的方程； 將待測(cè)三系雜交小麥種子抽樣發(fā)苗、提取葉片DNA，然后利用所述SSR分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的 引物進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)值代入上述方程，得到待測(cè)小麥雜交種檢測(cè)純度。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述三系雜交小麥種子分別與恢復(fù)系和保 持系種子按不同的設(shè)計(jì)比例混合形成多個(gè)試驗(yàn)組。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述三系雜交小麥種子與恢復(fù)系種子混合 發(fā)苗后提取DNA時(shí)， 以位于2A染色體上的Wmc474引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，建立的混入恢復(fù)系種子的小麥雜交種純 度理論值與檢測(cè)值的方程如下:y = 4.C1()+0.7875X，其中X為混入的恢復(fù)系種子的檢測(cè)值，y 為混入的恢復(fù)系種子的計(jì)算值； 以位于1B染色體上的BarcS的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，建立的混入恢復(fù)系種子的小麥雜交種 純度理論值與檢測(cè)值的方程如下:y = -〇. 1452+0.9314x，其中X為混入的恢復(fù)系種子的檢測(cè) 值，y為混入的恢復(fù)系種子的計(jì)算值； 所述三系雜交小麥種子與保持系種子混合發(fā)苗后提取DNA時(shí)， 以位于2A染色體上的Wmc474的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，建立的混入保持系種子的小麥雜交種 純度理論值與檢測(cè)值的方程如下：y = 〇. 2109+0.6797x，其中X為混入的保持系種子的檢測(cè) 值，y為混入的保持系種子的計(jì)算值； 以位于1B染色體上的BarcS的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，建立的混入保持系種子的小麥雜交種 純度理論值與檢測(cè)值的方程如下：y = 〇. 4083+0.7583x，其中X為混入的保持系種子的檢測(cè) 值，y為混入的保持系種子的計(jì)算值。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三系雜交小麥種子純度分子標(biāo)記及其引物對(duì)和應(yīng)用，其中的分子標(biāo)記為SSR分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為位于2A染色體上的Wmc474或位于1B染色體上的Barc8。本發(fā)明可準(zhǔn)確鑒定AL型三系雜交小麥種子純度。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105671041
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610162345
【發(fā)明人】田笑明, 聶迎彬, 劉小芳
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)墾科學(xué)院
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月21日