具有腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的減少作用的雙歧桿菌的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 本申請是國際申請日為2011年7月5日、國際申請?zhí)枮镻CT/肝2011/065350、進入國 家階段的申請?zhí)枮?01180033393.0、發(fā)明名稱為"具有腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的減少作用的雙歧桿 菌"的PCT申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本申請發(fā)明設(shè)及腸內(nèi)細菌的狀態(tài)的改善方法。更具體地，設(shè)及減少腸內(nèi)細菌導致 的作為腐敗氣味原因的嗎I噪系化合物的有用微生物的挑選和該挑選所得的微生物。
【背景技術(shù)】
[0003] 由于飲食生活的混亂、生活的不規(guī)則、壓力等，具有反復便秘、腹瀉，或腹?jié)q、產(chǎn)氣 等癥狀的人不斷增多。運些癥狀被認為受腸內(nèi)環(huán)境所影響，換言之，其原因在于腸內(nèi)菌群 (群落）中腐敗菌成為優(yōu)勢。并且，腸內(nèi)菌群在厭氧條件下由色氨酸產(chǎn)生嗎I噪或其衍生物等 腐敗氣味成分。對運種腸內(nèi)菌群與腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生的關(guān)系進行了大量研究(非專利文獻1)。
[0004] 另外，認為嗎I噪通過腸內(nèi)腐敗菌而由色氨酸產(chǎn)生、并由腸道吸收后，在肝臟中被代 謝為嗎I噪酪，進而與硫酸結(jié)合，形成硫酸嗎I噪酪。認為對健康人而言硫酸嗎I噪酪排泄至尿 中，但對透析患者等而言則成為尿毒癥等合并癥的病因（非專利文獻2)。
[0005] 對于作為腸內(nèi)有害物質(zhì)的嗎I噪等的除去，例如，專利文獻1中使用具有嗎I噪減少能 力的嗜熱雙歧桿菌化'フW'パ夕テ人レ厶/哥一子フ^ク厶）。另外，專利文獻2中記載了將 五層龍屬植物的提取物或微粉碎物與乳酸菌和/或雙歧桿菌并用來改善腸內(nèi)環(huán)境。進而，專 利文獻3中記載了利用含有丙酸菌的組合物來促進腸道內(nèi)的雙歧桿菌的生長，防止放出惡 臭氣體。另外，還報道了菊糖、低聚糖有助于改善腸內(nèi)菌群(非專利文獻3)。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1:日本特開2006-158216 專利文獻2:日本特開2007-031345 專利文獻3:日本特開2007-186529 非專利文獻 非專利文獻1:腸內(nèi)細菌學雜志第19卷169-177頁（2005) 非專利文獻2:透析會志24卷3號312-316頁（1991) 非專利文獻3:The Journal of Nutrition 129 口Su卵 1): 1438S-1441S (1999)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明要解決的技術(shù)問題 已知人的活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)會促進癌癥發(fā)生、老化，認為只要可積極地減 少活體內(nèi)的腐敗物質(zhì)，即可有助于人的健康。因此首先，本申請發(fā)明中的課題在于，有效利 用安全性高的有用微生物來有效地減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)。
[0008] 上述腐敗物質(zhì)主要在大腸內(nèi)生成時，作為大腸內(nèi)的優(yōu)勢微生物(菌種）的一例，有 乳酸菌、雙歧桿菌(雙歧桿菌屬）。該雙歧桿菌自古W來作為在活體內(nèi)發(fā)揮有用功能的微生 物而被用于食品，具有飲食經(jīng)驗的實際成績。因此，本申請的第1課題在于，由在人的活體內(nèi) (腸內(nèi)）占優(yōu)勢的雙歧桿菌中挑選可W有效地減少腐敗物質(zhì)的微生物(菌株）。
[0009] 然而，W往主要是利用體外的體系來尋找減少活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)的物 質(zhì)或微生物。由于目前還不能在體外再現(xiàn)腸內(nèi)菌群，因而對是否能反映實際腸內(nèi)狀況而進 行實驗存有疑問。因此，本申請發(fā)明的第2課題在于，提供合適的體外和體內(nèi)的體系來作為 減少在活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)的物質(zhì)或微生物的作用效果的驗證或?qū)ふ殷w系。
[0010] 進而，本申請發(fā)明的第3課題在于，提供對透析患者等具有減少作為合并癥病因的 硫酸嗎I噪酪在血清中的濃度的效果的微生物。
[0011] 用于解決技術(shù)問題的手段 作為安全性高的有用的微生物，本申請發(fā)明人基于本申請發(fā)明的篩選方法，從乳酸菌 和雙歧桿菌中分離有效減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的菌株，從而完成了本申請發(fā)明。
[0012] 作為減少在活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)的物質(zhì)或微生物的作用效果的驗證體 系，本申請發(fā)明人研究了下述方法:在體外進行篩選之際使用緩沖液再現(xiàn)菌體難W增殖的 條件，評價腐敗物質(zhì)的減少效果(減少能力）。并且，本申請發(fā)明人確立了減少腸內(nèi)細菌產(chǎn)生 的腐敗物質(zhì)的微生物(乳酸菌、雙歧桿菌等）的體外挑選方法和/或評價方法，該方法的特征 在于，將反應(yīng)溶液設(shè)定(設(shè)計)為乳酸菌、雙歧桿菌基本不增殖的條件，并且為減少腐敗物質(zhì) 所需的最低限的能量的葡萄糖量。
[0013] 另外，作為減少在活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)的物質(zhì)或微生物的作用效果的驗 證體系，本申請發(fā)明人研究了在體內(nèi)進行篩選之際使用小鼠，由血清中測量硫酸嗎I噪酪。并 且，本申請發(fā)明人確立了降低血清中的硫酸嗎I噪酪的產(chǎn)生的微生物(乳酸菌、雙歧桿菌等） 的體內(nèi)挑選方法和/或評價方法，該方法的特征在于，將低聚果糖(F0S)和/或低聚半乳糖 (G0S似及色氨酸α-色氨酸)添加至飼料(粉飼料）中飼養(yǎng)小鼠，評價血清中的硫酸嗎I噪酪 的濃度。
[0014] 進而，為了挑選可有效減少腐敗物質(zhì)的微生物(菌株），首先，本申請發(fā)明人著眼于 通常在人的活體內(nèi)（腸內(nèi)）占優(yōu)勢的雙歧桿菌，對短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)的 32菌株、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)的92菌株、青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolescent。的72菌株的總計196菌株實施篩選，在體外進行評價，預 挑選出9株作為安全性高的有用微生物。接著，為了驗證在活體內(nèi)減少腐敗物質(zhì)的作用、效 果，對于上述挑選的9株實施動物實驗，進行體內(nèi)評價，挑選出嗎I噪減少作用強并確認到血 清中的硫酸嗎I噪酪的減少作用的短雙歧桿菌0LB6129,從而完成了本申請發(fā)明。
[0015] 另外，本申請發(fā)明中，包含藥物和食品，其中含有上述挑選的嗎I噪減少作用強、顯 示血清中的硫酸嗎I噪酪的減少作用的雙歧桿菌作為有效成分。
[0016] 本說明書包含作為本申請優(yōu)選權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2010-152962號的說明書 和/或附圖中記載的內(nèi)容。
[0017]發(fā)明效果 本申請發(fā)明的短雙歧桿菌(B. breve)是來源于人的菌株，在該菌株自身不增殖的體系 中，實現(xiàn)了顯著減少嗎I噪和血清中的硫酸嗎I噪酪的優(yōu)異效果。另外，長期被食用的B. breve 的安全性高，本發(fā)明的雙歧桿菌0LB6129也可W在食品領(lǐng)域、藥品領(lǐng)域廣泛適用或應(yīng)用。
【附圖說明】
[0018] [圖1]對小鼠給予短雙歧桿菌(活菌）引起的對血清中的硫酸嗎I噪酪的濃度的影響 [圖2]對小鼠給予長雙歧桿菌(活菌）引起的對血清中的硫酸嗎I噪酪的濃度的影響
[圖3]對小鼠口服給予B. breve化B6129(活菌）中的、B. breve化B6129(活菌）的濃 度引起的對血清中的硫酸嗎I噪酪的濃度的影響
[圖4]在T0S丙酸瓊脂培養(yǎng)基中檢測到的便中（Fecal)和盲腸內(nèi)容物（cecal)中的B. breve 0LB6129的菌落數(shù)
[圖5]對小鼠口服給予B. breve化B6129(活菌）中的、有無添加 F0巧腦的對血清中的 硫酸嗎I噪酪的濃度的影響
[圖6]在T0S丙酸瓊脂培養(yǎng)基中檢測到的便中(Fecal)中的B. breve 0LB6129的菌落數(shù) 與有無添加 F0S的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0019] 1.首先 已知人的活體內(nèi)（腸內(nèi)）生成的腐敗物質(zhì)會促進癌癥發(fā)生、老化，認為只要可積極地減 少活體內(nèi)的腐敗物質(zhì)，即可有助于人的健康。作為主要在大腸內(nèi)生成的腐敗物質(zhì)，可W列舉 苯酪、對甲酪、嗎I噪、糞臭素、氨等。運些腐敗物質(zhì)之中，特別是嗎I噪、糞臭素等是惡臭成分， 另外還是有可能對健康帶來不良影響的成分，因而期望減少嗎I噪、糞臭素。
[0020] 作為大腸內(nèi)的優(yōu)勢微生物(菌種)的一例，有乳酸桿菌、雙歧桿菌(雙歧桿菌屬）。雙 歧桿菌自古W來作為在活體內(nèi)發(fā)揮有用功能的微生物而被用于食品。另外，雙歧桿菌被認 為具有整腸作用，因而還被用于整腸劑等，也有助于腸內(nèi)菌群的改善，認為通過改善腸內(nèi)環(huán) 境，對抑制腹瀉、防止皮膚粗糖、改善花粉病、免疫力的道教等也有效。
[0021] 2.用于驗證、尋找減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的微生物的作用效果的評價體系 2-1.減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的微生物的體外篩選或預篩選 為了使用微生物，在腸內(nèi)環(huán)境下減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)(在腸內(nèi)生成并產(chǎn)生惡臭成分等的 物質(zhì)），重要的是該特定的微生物在腸內(nèi)是優(yōu)先存在的。即，作為運種微生物應(yīng)具備的性質(zhì)， 要求對于適應(yīng)腸內(nèi)環(huán)境的條件的耐性。
[0022] 因此，理想的是適用符合腸內(nèi)環(huán)境中存在的微生物(菌體)的狀態(tài)(實際情況)的篩 選方法、評價方法。因此，在體外篩選減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的物質(zhì)或微生物時，本申請發(fā)明人 首先使用緩沖液來再現(xiàn)微生物難W增殖的條件，研究了腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的減少效果(減少能 力）的評價方法。通過采用上述條件，可W挑選即使微生物不增殖，也能夠除去腐敗物質(zhì)的、 在更接近腸內(nèi)環(huán)境的條件下優(yōu)異的微生物。例如，可設(shè)定對象微生物基本不增殖的條 件、并且減少腐敗物質(zhì)所需的最低限的能量那樣的條件，來決定反應(yīng)溶液的成分、濃度。
[0023] 更具體地，對于作為能量源的培養(yǎng)基成分的配合量，例如，使葡萄糖、乳糖、果糖等 的濃度比對象微生物的通常的培養(yǎng)條件低，并且作為可W除去腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的程度，可適 用 0.3 ~0.7(w/v)〇/〇。
[0024] 應(yīng)予說明，篩選(評價·挑選)方法(體外試驗）中，例示了對葡萄糖之類的碳源的反 應(yīng)溶液的濃度進行研究的結(jié)果，但即使是其它成分，也可w同樣決定反應(yīng)溶液的組成、濃 度。
[0025] 2-2.減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的微生物的體內(nèi)篩選 W前，未能實施動物實驗由體內(nèi)充分確認血清中的硫酸嗎I噪酪的減少效果。血清中的 硫酸嗎I噪酪的減少效果，雖然期待在腸內(nèi)發(fā)揮，但即使將微生物(菌