基于代謝物及基因表達(dá)篩選三七皂苷合成關(guān)鍵基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及Ξ屯中Ξ祗皂巧合成途徑關(guān)鍵基因的篩選，具體的是結(jié)合一年生Ξ屯 代謝物含量及Ξ祗皂巧合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行典型關(guān)聯(lián)分析（canonical correlation analysis)，篩選出^屯中對(duì)皂巧含量貢獻(xiàn)度較大的Ξ祗皂巧合成途徑關(guān)鍵 基因。
【背景技術(shù)】
[0002] Ξ^;：；(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.化en)為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)珍 貴藥材，其主要生理活性成分為Ξ屯皂巧。Ξ屯的應(yīng)用在古代主要作為金創(chuàng)要藥，用于體內(nèi) 外各種出血及跌打損傷、疲滯腫痛的治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明Ξ屯總皂巧和部分單體皂 巧在血液及屯、血管系統(tǒng)、系統(tǒng)代謝、免疫及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的生理活性，其多 方面的藥理作用及保健功能越來越受到人們的重視。目前Ξ屯皂巧的主要來源是從栽培Ξ 屯提取得到的，然而Ξ屯為多年生草本植物，生長周期長，且生長條件苛刻、地理分布窄，加 之病蟲害嚴(yán)重、連作障礙、農(nóng)藥殘留等問題，其產(chǎn)量已難W滿足快速增長的市場需求。
[0003] 近年來，針對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的基因調(diào)控已成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)， 而皂巧類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，其含量和組成主要取決于生物合成關(guān) 鍵基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。在植物細(xì)胞中，祗類化合物主要來源于兩個(gè)前體物質(zhì)，異戊締 基焦憐酸（IPP)及其異構(gòu)體二甲基締丙基焦憐酸(DMAPP)。細(xì)胞質(zhì)中的甲徑戊酸(MVA)途徑 和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸(MEP)途徑都能夠產(chǎn)生IPP和DMAPP，且兩條途徑 所產(chǎn)生的IPP可W穿過質(zhì)體膜互為對(duì)方所用。IPP分子和兩個(gè)DMAPP分子在法尼基焦憐酸合 酶(FPS)的作用下生成法尼基焦憐酸(FPP)，兩個(gè)FPP分子在整締合酶(SQS)的作用下W頭- 頭方式還原偶聯(lián)生成Ξ祗類物質(zhì)的前體整締。隨后，整締在整締環(huán)氧酶(SE)的作用下氧化 成2,3-氧化整締，達(dá)瑪燒二醇合成酶(DS)催化2,3-氧化整締環(huán)化為達(dá)瑪締二醇。達(dá)瑪締二 醇是達(dá)瑪燒型四環(huán)Ξ祗皂巧類的骨架，在細(xì)胞色素 P450單加氧酶及多種糖基轉(zhuǎn)移酶的作用 下最終形成不同類型的達(dá)瑪燒型四環(huán)Ξ祗皂巧。目前，植物Ξ祗皂巧合成途徑中的一些關(guān) 鍵酶基因已在人參屬植物中克隆和鑒定，研究證實(shí)它們的表達(dá)對(duì)Ξ祗皂巧合成起著重要調(diào) 控作用。此外，Niu等人對(duì)FPS，SS，沈和DS等基因在四年生Ξ屯開花期的表達(dá)進(jìn)行了分析，為 進(jìn)一步闡明皂巧類物質(zhì)在Ξ屯中的合成機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明W探索Ξ屯中Ξ祗皂巧合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平和代謝物含量的關(guān)聯(lián)性 為出發(fā)點(diǎn)，應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)一年生Ξ屯不同部位的代謝物含量進(jìn)行了 分析，同時(shí)利用巧光定量PCR技術(shù)對(duì)其皂巧合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，并且 通過典型關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建了Ξ屯基因-代謝物相關(guān)圖，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了篩選。在本發(fā)明之 前，尚未出現(xiàn)設(shè)及基于Ξ祗皂巧含量及其合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量對(duì)Ξ屯Ξ祗皂巧合成關(guān) 鍵基因進(jìn)行篩選的公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于構(gòu)建Ξ屯生長發(fā)育早期皂巧合成關(guān)鍵基因和代謝物含量的關(guān) 系網(wǎng)絡(luò)，篩選Ξ屯植物中對(duì)皂巧合成有重要作用的關(guān)鍵基因。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括下列步驟：
[0007] 1)分析一年生Ξ屯不同部位皂巧類物質(zhì)代謝輪廓。
[0008] 2)測定皂巧合成途徑關(guān)鍵基因在Ξ屯不同部位的表達(dá)。
[0009] 3)構(gòu)建基因-代謝物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，篩選Ξ屯中皂巧合成關(guān)鍵基因。
[0010] 上述方法中，所述Ξ屯不同部位為一年生Ξ屯的葉、葉柄及根部。
[0011] 步驟1)所述分析皂巧類物質(zhì)代謝輪廓是采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)不同 部位樣品甲醇提取物進(jìn)行檢測，使用內(nèi)標(biāo)法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。分析方法參照Li等人 "Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry"論文 中報(bào)道的皂巧定量方法。
[0012] 步驟2)所述Ξ屯不同部位皂巧合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)是采用巧光定量PCR(RT- Q-PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測的。具體是分別提取樣品RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，WcDNA 為模板，按照Takara公司SYBR Premix ExTaq?說明書中針對(duì)LightCycler?96實(shí)時(shí)巧光定 量PCR儀推薦的方法進(jìn)行設(shè)置。
[0013] 上述巧光定量PCR反應(yīng)中的特異性引物具體序列參見表1。
[0014] 表1 RT-Q-PCR中使用的基因引物序列
[0015]
[0016] 所述實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性2min，95°C變性10s，57°C退 火15s，72°C延伸30s，45個(gè)循環(huán)。
[0017] 步驟3)中所述基因-代謝物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和生物合成關(guān)鍵基因的篩選是通過典 型關(guān)聯(lián)分析將Ξ屯皂巧含量與皂巧合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量相結(jié)合分析得到的。具體的是 使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)對(duì)皂巧含量及皂巧合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行典型相關(guān)分析，變 量相關(guān)系數(shù)高于0.5作為篩選關(guān)鍵合成基因的標(biāo)準(zhǔn)。
[0018]本發(fā)明基于一年生Ξ屯中皂巧類物質(zhì)代謝及皂巧合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)構(gòu)建 了基因-代謝物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，對(duì)Ξ屯生長初期皂巧合成關(guān)鍵基因進(jìn)行了篩選，為進(jìn)一步闡明Ξ 屯中皂巧類物質(zhì)合成機(jī)制提供了重要信息，同時(shí)為通過基因調(diào)控等手段提高Ξ屯皂巧含量 提供了重要依據(jù)。
【附圖說明】
[0019 ]圖1為Ξ祗皂巧類物質(zhì)在生物體內(nèi)合成途徑；
[0020]圖2為一年生Ξ屯不同部位皂巧類物質(zhì)代謝輪廓譜圖，其中A是標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，Β 是一年生Ξ屯葉，C是一年生Ξ屯根，D是一年生Ξ屯葉柄；
[0021 ]圖3為皂巧在不同部位分布及含量熱圖；
[0022] 圖4為一年生Ξ屯不同部位皂巧含量PCA分析圖，其中1是一年生Ξ屯根，2是一年 生Ξ屯葉柄，3是一年生Ξ屯葉；
[0023] 圖5為皂巧合成途徑關(guān)鍵基因在一年生Ξ屯不同部位中的表達(dá)；
[0024] 圖6為一年生Ξ屯基因-代謝物關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，W下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一 步理解本發(fā)明，但不W任何形式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均 為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[00%]實(shí)施例1:代謝輪廓分析。
[0027] 1)材料與方法
[00%]所用植物材料來自于本實(shí)驗(yàn)室栽培Ξ屯，Ξ屯種子購于云南省文山州，于2013年 12月播種于溫室，嚴(yán)格按照Ξ屯種植標(biāo)準(zhǔn)，保證Ξ屯生長環(huán)境的陰涼避光及適宜的溫濕度。 于來年6月對(duì)一年生Ξ屯植株的葉、葉柄及根部分別取材，樣品經(jīng)液氮速凍后，冷凍保存于- 80°C冰箱。
[0029] 2)樣品提取
[0030] 將各樣品研磨成粉末，經(jīng)48小時(shí)的冷凍干燥后用甲醇對(duì)樣品進(jìn)行提取。準(zhǔn)確稱量 50mg樣品溶于1.5mL甲醇，滿旋Imin，室溫超聲提取半小時(shí)，所得混合溶液過夜靜置， 12000rmp離屯、取上清液。剩余物用甲醇再次提取，超聲處理1小時(shí)，離屯、，將兩次離屯、的上清 液混合用于皂巧含量的測定。根及葉柄提取物稀釋2倍，葉提取物稀釋5倍，所有樣品進(jìn)樣前 經(jīng)0.22WI1有機(jī)濾膜過濾。
[0031] 3)皂巧代謝輪廓分析
[0032] 參考Li等人在"Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrome化y"論文中報(bào)道的皂巧定量方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)上 述樣品提取物進(jìn)行分析得到不同部位代謝輪廓譜。