附柱中加入500ul緩沖液AW2，SOOOrpm離屯、Imin，倒掉廢液，將吸附柱放入 新的收集管中。
[0035] 9.將吸附柱放入新的收集管中，13000rpm離屯、3min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫 放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸附柱材料中殘余的漂洗液。
[0036] 10.將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50ul Buffer AE。室溫解化5minD8000轉(zhuǎn)離屯、Imin。
[0037] 11:重復(fù)步驟10。質(zhì)檢后放-80°C保存。
[003引二、PCR擴(kuò)增
[0039] 用于檢測IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)的檢測引物和化qman探針于ABI公司購買，并對 樣本基因組DNA在Roche LC480 Π PCR儀上進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，所述化qman探針被兩種巧 光染料Vic、Fam雙標(biāo)記，該探針分別是針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針 才能擴(kuò)增出各自對應(yīng)的基因型；
[0040] 按下列組分配置PCR反應(yīng)體系，配制過程在冰上進(jìn)行。
[0041]
[0042] 按下列條件進(jìn)行反應(yīng)：
[0043] 起始95°C預(yù)熱lOmin，然后95°C變性10s，60°C退火和延伸30s，循環(huán)45次。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 該實(shí)施例用實(shí)施例1的方法，對191例慢性乙型肝炎患者、177例乙型肝炎肝硬化患 者、48例乙型肝炎肝衰竭患者、93例皿sAg和皿eAg皆陰性的攜帶者和112例國際保健體檢中 屯、的健康體檢者的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)的基因型和等位基因進(jìn)行了分析。
[0046] 一、試驗(yàn)對象
[0047] 本研究于2013年11月至2015年11月期間，收集了就診于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一 醫(yī)院住院或者口診就診的皿sAg和皿eAg皆陰性的攜帶者93例、慢性乙型肝炎患者191例、乙 型肝炎肝硬化患者177例、乙型肝炎肝衰竭患者48例和國際保健體檢中屯、的健康體檢者112 例，共621例。
[004引患者入選標(biāo)準(zhǔn)
[0049] 按照2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》中規(guī)定的病例判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病例診斷：
[0050] 1.攜帶者:血清皿sAg陽性，1年內(nèi)連續(xù)隨訪2次W上均顯示血清ALT和AST在正常范 圍，肝組織學(xué)檢查無病變或病變輕微。
[0051] 2.慢性乙型肝炎：既往有乙型肝炎病史或皿sAg陽性超過6個月，現(xiàn)皿sAg和（或） 皿V DNA仍為陽性者，ALT持續(xù)或反復(fù)異?；蚋谓M織學(xué)檢查有肝炎病變。
[0052] 3.乙型肝炎肝硬化:①組織學(xué)或臨床提示存在肝硬化的證據(jù);②病因?qū)W明確的皿V 感染證據(jù)。通過病史或相應(yīng)的檢查予W明確或排除其他常見引起肝硬化的病因如HCV感染、 酒精和藥物等。
[0053] 按照2012年版《肝衰竭診治指南》中規(guī)定的病例判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病例診斷：
[0054] 4.乙型肝炎肝衰竭:①黃痘迅速加深，血清TBIL大于正常值上限10倍或每日上升 M7.1皿〇1/1;②出血傾向，PTA含40/〇(或INRM .5)，并排除其他原因者。
[0055] 患者排除標(biāo)準(zhǔn)
[0056] 1)排除合并其他肝病的患者，如其它類型肝炎病毒感染、藥物性肝病、自身免疫性 肝病、酒精性肝病等；
[0057] 2)排除近期其他因素引起肝損害的患者，如中毒、細(xì)菌感染；
[005引3)排除有長期飲酒史，一般超過5年；
[0059] 4)排除伴有嚴(yán)重的屯、臟、腎臟、腦、肺等器質(zhì)性病變的患者；
[0060] 5)排除患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的膽道腫瘤和胃腸道腫瘤患者。
[0061 ] 健康對照入選標(biāo)準(zhǔn)
[0062] 1)皿sAg、皿eAg、皿V-DNA等標(biāo)志物陰性者；
[0063] 2)肝臟功能正常者。
[0064] 健康對照排除標(biāo)準(zhǔn)
[0065] 皿sAg或皿eAg或皿V-DNA標(biāo)志物陽性，并排除其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、 酒精性肝病及腎臟、屯、臟、腦部等疾病的體檢健康者。
[0066] 二、化rdy-Weinbe巧遺傳平衡檢驗(yàn)
[0067] 比-6基因 rs2066992位點(diǎn)經(jīng)過化rdy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)后，符合化rd}f- Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性(表1)。
[0068] 表1 IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)基因型遺傳平衡檢驗(yàn)
[0069]
[0070] Ξ、比-6基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系分析
[0071] 在IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)，乙型肝炎肝硬化組和慢乙肝組的基因型頻率和等位 基因頻率比較差異有顯著性意義^2 = 6.62^ = 0.04;乂2 = 4.04，口 = 0.04)(表2)。其余各組 間比較都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0072] 表2 IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)基因型和等位基因在兩組中的分布
[0073]
[0074] 因此，用本發(fā)明的方法解析了 IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物與乙型肝炎肝硬化 病情轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系。
[0075] 應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對本發(fā)明作各種 改動或者修改，但所作改動或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，其特征在于：IL-6 基因的rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。2. 與乙型肝炎向肝硬化轉(zhuǎn)移相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，其特征在于：IL-6 基因的rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。3. 與乙型肝炎肝硬化相關(guān)的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物，其特征在于：IL-6基因的 rs2066992位點(diǎn)表現(xiàn)為TT基因型或T等位基因。4. 一種試劑，其特征在于：用于檢測權(quán)利要求1-3任一所述的IL-6基因 rs2066992位點(diǎn) 的試劑。5. -種檢測權(quán)利要求1-3任一所述IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物的方法，其特征在 于:采用Taqman探針法，包括如下步驟： 1) 于ABI公司購買用于檢測IL-6基因 rs2066992位點(diǎn)的引物和探針，并對樣本基因組 DNA在Roche LC480 Π PCR儀上進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，所述Taqman探針被兩種熒光染料Vic、 Fam雙標(biāo)記，該探針分別是針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能擴(kuò)增出 各自對應(yīng)的基因型； 2) 按下列條件進(jìn)行反應(yīng):起始95°C預(yù)熱lOmin，然后95°C變性10s，60°C退火和延伸30s， 循環(huán)45次;產(chǎn)物在Roche LC480 Π 型熒光定量PCR儀上掃描讀取數(shù)據(jù)，分析得出研究對象的 基因型。6. 權(quán)利要求4所述試劑在制備用于HBV慢性感染者病情轉(zhuǎn)歸的診斷試劑盒中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求4所述試劑在制備用于乙型肝炎感染人群疾病向肝硬化發(fā)展診斷試劑盒中 的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求4所述試劑在制備用于乙型肝炎肝硬化診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis？B？virus，HBV)感染者病程進(jìn)展的個體易感性。具體地，本發(fā)明涉及與HBV慢性感染者病程進(jìn)展相關(guān)的易感基因IL-6的rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物在HBV慢性感染者病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)警以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種與慢性乙型肝炎病情轉(zhuǎn)歸，尤其是與乙型肝炎肝硬化轉(zhuǎn)歸相關(guān)的IL-6基因rs2066992位點(diǎn)標(biāo)志物及其檢測試劑和檢測方法。對具有TT基因型或T等位基因慢乙肝患者，則可對之進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)，例如建議其盡早進(jìn)行治療性預(yù)防等措施，這樣可針對性地降低這些易感人群發(fā)生乙肝肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105671160
【申請?zhí)枴緾N201610115796
【發(fā)明人】鄭敏, 陳智, 夏彩霞, 劉艷寧, 陳 峰, 黃春紅, 樓國華, 朱偉
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月1日