一種黃牛spag17基因插入/缺失的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物技術(shù)與家畜育種領(lǐng)域，設(shè)及基因插入/缺失（indel)的檢測(cè)， 特別設(shè)及一種檢測(cè)夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失（indel)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物育種技術(shù)主要包括W表型和表型值為基礎(chǔ)的常規(guī)育種技術(shù)和WDNA多態(tài)為基 礎(chǔ)的分子育種技術(shù)。作為分子育種技術(shù)體系的重要組成部分，分子標(biāo)記輔助選擇(marker- assisted selection, MAS) 育種技術(shù)首先檢測(cè)重要基因的 DNA 多態(tài)性 ，然后分析 DNA 多態(tài)與 遺傳性狀之間的相關(guān)性，最后再根據(jù)與遺傳性狀顯著相關(guān)的DNA標(biāo)記進(jìn)行性狀選擇。作為現(xiàn) 代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展過(guò)程中孕育而生的新技術(shù)，MAS育種技術(shù)可W在DNA水平上快速準(zhǔn)確 地分析個(gè)體的遺傳組成，該方法通過(guò)有性雜交將目的基因轉(zhuǎn)移到需要改良的親本中，將目 標(biāo)基因型的鑒定與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，提高育種目標(biāo)的定向 性。該方法在克服表型鑒定的困難、早期選擇、進(jìn)行無(wú)損害的性狀評(píng)價(jià)和選擇及提高回交育 種效率等方面具有優(yōu)越性。
[0003] 在MAS育種技術(shù)體系中，尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點(diǎn)，并分析 重要功能基因遺傳變異位點(diǎn)與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性，是分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用的前提和 關(guān)鍵。作為分子遺傳標(biāo)記的重要方式之一，插入/缺失（indel)是一種新型分子標(biāo)記。indel 是指DM序列上核巧酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種 之間染色體基因組的多樣性。隨著對(duì)基因組研究的逐漸深入，基因組上的一種亞顯微水平 的結(jié)構(gòu)變異--拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)被廣泛報(bào)道，現(xiàn)已成為"基因組 變異"到"表型變化"的另一研究熱點(diǎn)。由于CNV設(shè)及到更多的基因序列，甚至包含整個(gè)功能 基因，因此，能夠通過(guò)基因劑量效應(yīng)的改變，進(jìn)而影響該基因控制的表型。在近年的《Genome Research》雜志上，Bic化art等人（2012)利用全基因組測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)到了許多個(gè)與牛生 長(zhǎng)、肉質(zhì)相關(guān)的QTLs位于CNVs區(qū)域內(nèi)，表明影響個(gè)體表型差異的CNVs廣泛存在于基因組中。 indel是指基因組中片段長(zhǎng)度在l-50bp之間的插入或缺失，可能包括微小CNV，利用indel分 析個(gè)體基因組可W更好地解釋個(gè)體的表型差異，因此從DNA水平上對(duì)小片段核巧酸的差異 進(jìn)行indel檢測(cè)在動(dòng)物分子育種的MS體系中具有重要意義。
[0004] 在基因組中，CNV通常發(fā)生的區(qū)域含有大片段序列重復(fù)化omologous repeats)或 SD序列（Segmen1:al duplications) eSD序列是指由于基因組重排產(chǎn)生的長(zhǎng)度大于Ikb串聯(lián) 重復(fù)的DNA片段，且序列之間具有90% W上的同源性(Redon et al 2006)。
[0005] CNV形成的變異機(jī)制主要有：非等位同源重組NAHR(Non-allelic homologous recombination)、非同源末端連接N肥J(Non-homologous end joining)、復(fù)制滑動(dòng) (Replication slippage)和反牽專錄座（Retro transposition)。
[0006] 為探索從基因組CNVs到表型變化的作用機(jī)理，科研人員通過(guò)大量的假設(shè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證，認(rèn)為CNVs影響表型的作用機(jī)制主要有W下幾個(gè)方面:1)小片段的重復(fù)、缺失/插入，改變 單個(gè)基因或與其臨近的幾個(gè)基因，直接導(dǎo)致基因劑量的改變、使相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量的 減少或增加，進(jìn)而引起表型的變化。2)DNA片段的倒位，功能基因倒位至無(wú)活性異染色體區(qū) 域，使基因不表達(dá)或表達(dá)量極少，從而導(dǎo)致表型的變化。3)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，間接影 響基因表達(dá)量。
[0007] 另外，有些CNVs具有一定的干擾效應(yīng)，但設(shè)及到的區(qū)域通長(zhǎng)不會(huì)引起重要的功能 基因改變。正常個(gè)體的一個(gè)基因發(fā)生拷貝數(shù)變異不一定會(huì)導(dǎo)致表型的相關(guān)改變，因?yàn)楹芏?表型都是多基因控制的數(shù)量性狀，該基因發(fā)生CNVs所產(chǎn)生的功能缺失會(huì)被其他功能類似的 基因補(bǔ)償，從而緩沖了運(yùn)種不平衡作用。所W，在群體遺傳研究中，微小CNV(插入/缺失)作 為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。因此，indel在育種的研究中 具重要意義，倍受動(dòng)物育種專家的青睞。
[0008] 插入/缺失（indel)是DNA或蛋白質(zhì)序列水平上發(fā)生頻率僅次于殘基替換的進(jìn)化改 變，indel多態(tài)性是基因組中一種特殊類型的二等位基因遺傳標(biāo)記，表現(xiàn)為基因組中插入或 缺失了不同大小的小片段DNAnindel大致分成W下5大類：（1)單堿基對(duì)的插入/缺失；（2)單 一堿基的插入/缺失；（3)重復(fù)單元為2~15堿基的多堿基對(duì)插入/缺失；（4)轉(zhuǎn)座子插入/缺 失；（5)任意DNA序列的插入/缺失多態(tài)性。隨著比較基因組學(xué)的深入研究，indel為理論研究 和遺傳育種應(yīng)用研究提供了大量的生物信息，其作為新一代的遺傳學(xué)鑒定標(biāo)記，兼具SNP的 優(yōu)點(diǎn)，與SNP相比，均是源于單突變事件，其突變頻率較低，約為10-8,相對(duì)比較穩(wěn)定。在結(jié)構(gòu) 上屬于二等位基因多態(tài)性，等位基因都固定且已知，能夠通過(guò)很小的擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增（< 50bp)，提高了擴(kuò)增高度降解DNA的成功率。作為一種重要的遺傳標(biāo)記，indel的研究最早聚 焦在分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。遍布于整個(gè)基因組的indel頻率僅次于SNP，位居第二，其 中約Ξ分之一位于已知的基因區(qū)域內(nèi)，還有一些位于決定基因功能的關(guān)鍵性區(qū)域，如啟動(dòng) 子區(qū)和外顯子區(qū)。分子生物學(xué)家最早將其用于基因表型相關(guān)的研究，希望通過(guò)將人類性狀、 疾病癥狀或是易感性進(jìn)行聯(lián)系，從而達(dá)到基因診斷和治療的目的。2005年，Bhangale等報(bào) 道了一種能夠從目的基因中全面識(shí)別indel變異的方法，并應(yīng)用該方法從330個(gè)備選基因中 找到2393個(gè)indel變異位點(diǎn)，得出人類基因組中插入/缺失態(tài)出現(xiàn)的頻率高于插入多態(tài)性的 結(jié)論，同時(shí)提出，indel和SNP的形成機(jī)制可能不同，但其進(jìn)化史是相似的。然而相關(guān)的后續(xù) 報(bào)道并不是很多，甚至在近幾年有遞減的趨勢(shì)。
[0009] 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，社會(huì)對(duì)黃牛產(chǎn)品的需求不斷加強(qiáng)，但 由于近年來(lái)牛肉、牛奶等產(chǎn)品嚴(yán)重短缺，所W黃牛育種專家期望更早、更好、更快地獲得黃 牛產(chǎn)品的優(yōu)良品種。在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效的黃牛育種目標(biāo)上，黃牛育種專家一直關(guān)注生長(zhǎng)發(fā) 育性狀，但僅靠傳統(tǒng)育種手段是不行的，還需要依靠分子育種技術(shù)。即首先在DNA水平上篩 查和檢測(cè)與黃牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀密切相關(guān)的DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行基因多態(tài)性的檢測(cè)，最后是進(jìn) 行基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析，從而實(shí)現(xiàn)MS和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇。
[0010] 精子相關(guān)抗原17(Spe;rm-associated antigen 17,SPAG17)基因，又叫做鞭毛中央 對(duì)相關(guān)(Flagellar cenhal pair-associated,PF6)基因。在人上SPAG17基因還通過(guò)影響 骨骼的生長(zhǎng)從而影響人的身高。人類的身高是一種可遺傳的典型多基因性狀，是許多生長(zhǎng) 發(fā)育過(guò)程的結(jié)果。大多數(shù)與身高相關(guān)的基因在骨骼發(fā)展中發(fā)揮作用。SPAG17基因的單核巧 酸多態(tài)性與人類身高有關(guān)。然而，目前尚不清楚運(yùn)個(gè)基因如何影響線性增長(zhǎng)。Maria 化genia Teves等(2015)表明，SPAG17基因有針對(duì)性的突變會(huì)導(dǎo)致骨骼崎形。后肢在突變體 長(zhǎng)度明顯短于野生型老鼠。研究顯示成熟的股骨和腔骨的差異表明改變肢體模式。形態(tài)學(xué) 研究顯示，通過(guò)增加骨小梁面積增加與骨區(qū)域總面積的比率可w增加骨形成，導(dǎo)致在股骨 骨髓面積/總面積的比率減少。通過(guò)硝酸銀染色證明可W增加股骨的礦物。此外，骨巧素和 具有鋒指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子在突變小鼠股骨中比野生型老鼠中表達(dá)要高。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，股 骨骨縮短可能是由于過(guò)早骨化。另一方面，由于軟骨和骨骼發(fā)育延遲腔骨似乎稍短。形態(tài)學(xué) 研究顯示，在生長(zhǎng)板和骨的形成減少。運(yùn)些缺陷并不影響骨礦化，盡管初級(jí)骨的體積和骨巧 素水平和具有鋒指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子變得更高。SPAG17基因在骨骼生長(zhǎng)和礦化的調(diào)控，也許 因?yàn)樗诔跫?jí)纖毛的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的角色。Xu Kang等（2015)掲示SPAG17基因與雄 性不育相關(guān)。Silina，Karina等(2011)掲示SPAG17基因與癌癥的免疫抗原相關(guān)。
[0011] 目前，對(duì)SPAG17基因的研究主要集中在與骨骼相關(guān)方面的研究上，Weedon等 (2008) ;Takeuchi等(2009) ;N'Diaye等(2011) ;Teves等(2015)研究表明SPAG17基因與人的 身高相關(guān)。對(duì)中國(guó)地方黃牛SPAG17基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匿乏，該基因位點(diǎn)的功能研究 更是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃牛SPAG17基因插入/缺失的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，從 而加快良種選育速度。
[0013] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0014] -種黃牛SPAG17基因插入/缺失的檢測(cè)方法，W待測(cè)夏南牛(黃牛品種)全基因組 DNA為模板，W引物對(duì)P1為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增夏南牛SPAG17基因片段，該片段包含夏南牛 SPAG17基因8-bp插入/缺失多態(tài)性位點(diǎn);再對(duì)PCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳;根 據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多態(tài)性位點(diǎn)的插入/缺失多 態(tài)性;所述的引物對(duì)P1為：
[0015] 上游引物：5 ' -ACATGGGAGAAATACCCG-3 ' ；
[0016] 下游引物：5 ' -GTCTGAAGATGGCAAACG-3 '。
[0017] 所述PCR的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0018] 1)94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入步驟2);
[0019] 2)94°C變性30s，復(fù)性30s，72°C延伸20s;共18個(gè)循環(huán);第一個(gè)循環(huán)中復(fù)性溫度為68 °C，剩余每個(gè)循環(huán)中復(fù)性溫度較上一個(gè)循環(huán)降低rc，然后進(jìn)入步驟3);
[0020] 3)94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸20