一種用于檢測(cè)alk融合斷裂點(diǎn)的探針組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測(cè)及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于檢測(cè)ALK融合斷裂點(diǎn) 的探針組及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] ALK融合基因是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者接受祀向治療中重要的依據(jù)。ALK陽性 的NS化C雖然僅占全部NS化C的5 %，但是每年新發(fā)病例數(shù)在中國(guó)仍接近30，000例。同時(shí)，ALK 融合基因可發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的斷裂，同時(shí)其可W和多種基因發(fā)生融合，根據(jù)斷裂點(diǎn)的不同可 區(qū)分為許多種，為檢測(cè)帶來了極大的困難。為了準(zhǔn)確檢測(cè)ALK融合基因 W及利用基因捕獲加 二代測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)ALK融合基因。綜上所述，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)ALK融合的捕獲探針組 及試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)ALK融合斷裂的捕獲探針組及其試劑盒，所 述探針組包含能特異性捕獲ALK全外顯子的探針?？蒞全面、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)ALK融合及斷 裂。
[0004] -方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)ALK融合斷裂的探針組，所述探針組包含230個(gè) 寡核巧酸探針，所述230個(gè)寡核巧酸探針的堿基序列如SEQ ID No. 1-230所示。
[0005] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于一種檢測(cè)ALK融合斷裂的試劑盒。所述試劑盒包 括:本發(fā)明所述的用于ALK融合斷裂檢測(cè)的探針組、富集緩沖液化、富集緩沖液HY、文庫富集 結(jié)合緩沖液、洗涂緩沖液WB1、洗涂緩沖液WB2、文庫富集洗脫液、緩沖液肥、PCR反應(yīng)液、產(chǎn)物 純化洗脫液。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)ALK融合斷裂序列的操作過程，包括W下幾個(gè)步驟：
[0007] (1)設(shè)計(jì)相應(yīng)的捕獲探針
[0008] (2)DNA提取、片段化及構(gòu)建DNA文庫
[0009] (3)文庫目標(biāo)區(qū)域捕獲及定量
[0010] (4)新一代基因測(cè)序
[0011] (5)基因序列的生物信息分析
[0012] (6)腫瘤基因的突變信息分析
[0013] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供一種對(duì)ALK融合基因進(jìn)行全基因深度捕獲并高通量測(cè)序，找到 斷裂點(diǎn)的方法。進(jìn)一步針對(duì)斷裂點(diǎn)設(shè)計(jì)個(gè)性化引物進(jìn)而對(duì)預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測(cè)。具體為:從待測(cè)樣 本中提取DNA進(jìn)行ALK基因的捕獲，進(jìn)行新一代測(cè)序分析，序列分析ALK基因，找出ALK融合基 因 W及斷裂點(diǎn)的位置;設(shè)計(jì)個(gè)性化的引物去擴(kuò)增ALK基因融合位置，檢測(cè)樣本血液中的融 合基因所占比例，對(duì)預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0014] 更優(yōu)選的，本發(fā)明提供一種對(duì)ALK融合基因進(jìn)行捕獲的方法，具體捕獲過程包括： 對(duì)待檢測(cè)DNA全基因組進(jìn)行隨機(jī)打斷成200-30化P大小的片段后，部分片段同時(shí)含有ALK和 其融合基因的序列；邁基諾公司擁有ALK外顯子的捕獲探針SEQ ID No.1-230,該探針進(jìn)一 步修飾后攜帶生物素標(biāo)記，并能特異性雜交ALK相關(guān)的序列，因此含有ALK和其融合基因的 序列通過探針上生物素與磁珠的結(jié)合，被特異性雜交下來;將不含ALK的序列洗涂除去后； 通過對(duì)融合片段進(jìn)行左端lOObp，右端l(K)bp測(cè)序可W發(fā)現(xiàn)，如果右邊是ALK序列，而左端序 列為于其他基因上，則能夠判斷出ALK融合的基因類型。
[0015] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0016] 1、本發(fā)明設(shè)及了可進(jìn)行快速準(zhǔn)確捕獲ALK融合基因序列的探針組，能夠提高檢測(cè) 特異性，對(duì)捕獲出目標(biāo)區(qū)域的文庫標(biāo)本利用高通量測(cè)序技術(shù)使用化Seq 2000測(cè)序，通量高、 準(zhǔn)確度高、成本低。
[0017] 2、本發(fā)明靈敏度高，并由于該方法是WDNA文庫的方式進(jìn)行捕獲測(cè)序，因此，樣品 DNA的部分降解對(duì)最后的結(jié)果幾乎不會(huì)產(chǎn)生影響，而過量的探針，保證了對(duì)目標(biāo)片段的完全 捕獲，所W，即使可能出現(xiàn)的某些豐度較低的變異DNA也能被捕獲并檢測(cè)出來，其靈敏度相 對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序要高出許多。為全面檢測(cè)準(zhǔn)確的進(jìn)行ALK融合基因序列檢測(cè)提供了 更好的平臺(tái)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] W下通過實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
[0019] 實(shí)施例1:本發(fā)明探針組的設(shè)計(jì)和制備
[0020] ALK基因全外顯子序列位置如表1所示，根據(jù)ALK基因的全外顯子序列，對(duì)每個(gè)區(qū)域 中非重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)78bp的探針序列，每個(gè)序列沿著基因位置挪動(dòng)設(shè)計(jì)。利用原位合成技術(shù)， 大量合成設(shè)計(jì)的探針(MyGenostics.US)，并利用PCR的方法擴(kuò)增出大量的帶有生物術(shù)標(biāo)記 的探針。
[0021] 表1:
[0022]
[0023]
[0024] 所述PCR方法具體為：
[0025] 將上述合成的探針均勻混合在總體積1.2ml的地2〇中，取其中15μ1利用通用的PCR 引物（5 '端序列為GACTACATGGGACAT、3 '端的序列為GGAACCTACGACGTA)，分Ξ管進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，其中引物GACTACATGGGACAT為帶有生物素標(biāo)記的引物。
[0026] PCR擴(kuò)增體系：底物0ΝΑ，5μ1;正向引物（25μΜ)，化1;反向引物（25μΜ)，化l;MgCl2 (50mM)，化l;10x Platinum Taq緩沖液（購(gòu)自Life Technologies),5yl;dNTPs(每種lOmM)， 化l;Platin皿 Taq(抓/μ1,購(gòu)自Life Technologies)，化1;出0,27μ1;總體積50μ1。
[0027] 擴(kuò)增條件:98°C，30s; (98°C，30s，60°C，25s，72°C，45s)35個(gè)循環(huán);72°C，5min。
[002引將PCR產(chǎn)物用MinElute PCR純化試劑盒（購(gòu)自Life Technologies)純化后，取 50化肖，用17化6親和素磁珠(購(gòu)自Invi化ogen)將PCR產(chǎn)物結(jié)合下來。然后加入堿性NaOH將沒 有生物素的互補(bǔ)鏈變性、洗脫下來;然后將整個(gè)磁珠用l00°C的甲酯胺液體洗涂，使探針從 磁珠上分離下來。用乙醇沉淀后即得到生物素標(biāo)記的本實(shí)施例的探針組，所述探針組的堿 基序列如SEQ ID No. 1-230所示。
[0029] 實(shí)施例2:本發(fā)明試劑盒組成、制備及使用
[0030] 本實(shí)施例所述的用于ALK融合斷裂序列檢測(cè)試劑盒，是通過檢測(cè)ALK全基因組的突 變來進(jìn)行分子遺傳學(xué)檢測(cè)的試劑盒。
[0031 ]所述試劑盒包含的成分為:實(shí)施例1所獲得的探針組、緩沖液HY、緩沖液化、文庫富 集結(jié)合緩沖液、洗涂緩沖液WB1、洗涂緩沖液WB2、緩沖液肥、PCR反應(yīng)液、產(chǎn)物純化洗脫液。具 體組成為：
[0032]
[0033] 所述試劑盒的使用方法為：
[0034] 1、樣本文庫制備：
[0035] (1)超聲片段化:起始量為化g,用1 X low TE Buffer稀釋到30ng/yL。采用Covaris S2超聲儀進(jìn)行超聲片段化，按標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定Covaris系統(tǒng)的值，6次循環(huán)X 60s，水浴溫度:5°C，占 空比：20% ,強(qiáng)度：5,模式:Rrequency swe巧ing。
[0036] (2)末端補(bǔ)平：分別取lOOyL片段化的DNA、8yL dNTPs、2化 End Polishing酶I (l〇UAiL，Agilent)、16化 End Polishing酶Π (5UAiL，Agilent),加水到總體積200yLe25°C 解育30min。用化reLink PCR純化試劑盒（Invitrogen)純化DM。
[0037] (3)連接 PI 和 P2 接頭：Illumina 接頭 l(PleA)50 皿 ol/L 和接頭 2(P2eA)50 皿 ol/L 各 26化（Illumina)，末端補(bǔ)平的DM 4祉L，T4DNA連接酶10化巧ου)，加水到總體積2(K)yL，室溫 解育 15min。產(chǎn)物純化。采用預(yù)制的2%SizeSelect Gel(Applied Biosys-tems)，放到E-Gel iBase上。連接純化后的DNA片段分3份各20化加入上樣孔，分子量對(duì)照用0.2yg的50bp ladder，無樣品孔及回收孔分別用20化、2扣L水填滿，電泳約12min，吸出進(jìn)入樣品回收孔的 150~200bp之間的DNA片段。
[0038] (4)DNA片段回收：采用預(yù)制的2%SizeSelect Gel(Applied Biosys-tems)，放到 E-Gel iBase上。連接純化后的DNA片段分3份各20化加入上樣孔，分子量對(duì)照用0.化g的 50bp ladder，無樣品孔及回收孔分別用20化、2扣L水填滿，電泳約12min，吸出進(jìn)入樣品回 收孔的150~20化P之間的DNA片段。
[0039] (5)缺口平移：回收的純化片段需要采用切口平移法進(jìn)行文庫模板量的平衡的線 性擴(kuò)增。每100化回收樣品加400化的master mix(Agilent),按程序進(jìn)行反應(yīng):72°C20min, 95°C5min;然后 95°(：153,54°(：153,70°(：1111111進(jìn)行10到12個(gè)循環(huán);70°(：再延伸5111111;4°(：保存。 純化產(chǎn)物并定量，取化L樣本產(chǎn)物進(jìn)行Flash Gel(2.2% ,Lonza公司）電泳，約lOmin。
[0040] 2、樣本富集雜交：
[0041 ] (1)雜交液制備：化g DNA基因文庫（20ul，200ngAU)、13ul緩沖液化、5μ1 GenCapTM 審恪好的探針混勻并放置在95°C7分鐘，65°C2分鐘，（注:探針必須在95°C的條件下加熱)再 加入22μ1預(yù)熱的緩沖液HY(65°C預(yù)熱，使用前充分震蕩重懸沉淀）d65°C雜交22小時(shí)。
[0042] 注:緩沖液HY的體積根據(jù)所制備文庫體積調(diào)整而調(diào)整，調(diào)整比例為HY緩沖液體積 =總體積/1.8
[0043] (2)純化:此步驟所用的緩沖液除了 WB2外，均室溫放置。
[0044] 1)取1.5ml離屯、管，加入50ul My化e磁珠，劇烈震蕩至少5秒，短暫離屯、收集管壁的 液體，將離屯、管放置在磁力架(例如:DynaMag)上1分鐘；
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