產(chǎn)蛋下降重要病毒環(huán)介導(dǎo)多重pcr快速檢測(cè)引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及產(chǎn)蛋下降重要病毒環(huán)介導(dǎo)多重PCR快速檢測(cè)引物，屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近些年來(lái)，我國(guó)種禽和蛋禽在飼養(yǎng)過(guò)程中因傳染病導(dǎo)致的產(chǎn)蛋下降問題愈來(lái)愈嚴(yán) 重，主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降，如產(chǎn)蛋量難W達(dá)到正常峰值或驟然下降，出現(xiàn)軟殼 蛋、沙殼蛋、薄殼蛋、崎形蛋及小型蛋等，嚴(yán)重影響種(蛋)禽的生產(chǎn)性能，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損 失。現(xiàn)有研究表明，很多病原均可導(dǎo)致種(蛋)禽產(chǎn)蛋下降，如禽坦布蘇病毒(ATV)、產(chǎn)蛋下降 綜合征病毒(EDSV)、朋亞型禽流感病毒化9AIV)、禽1型副黏病毒(APMV-1)及沙口氏菌等多 種細(xì)菌性病原。產(chǎn)蛋家禽的流行病學(xué)調(diào)查表明，60%W上的產(chǎn)蛋下降病例是由運(yùn)些病原中的 一種形成單純感染或幾種病原混合感染引起，發(fā)病時(shí)的臨床癥狀與剖檢病變十分類似，有 的還繼發(fā)或并發(fā)其他病原而導(dǎo)致誤診或使病情復(fù)雜化延誤治療，從而引發(fā)更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì) 損失。
[0003] 禽坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的RNA病毒，是2010年4月在我國(guó)浙江、江蘇 和福建等地新發(fā)現(xiàn)的引起開產(chǎn)蛋鴨、種鴨出現(xiàn)W產(chǎn)蛋驟降、低死亡為主要特征的急性高度 接觸性傳染病的病原。該病毒感染產(chǎn)蛋家禽后主要造成產(chǎn)蛋家禽的卵泡膜充血、出血，卵泡 變性、萎縮及癒痕化等，極大的影響家禽的產(chǎn)蛋性能，發(fā)病后2天后家禽產(chǎn)蛋率下降達(dá)30%- 70%，嚴(yán)重的于發(fā)病后7~14天停產(chǎn)，部分感染病例出現(xiàn)不可逆性停產(chǎn)。到2014年底，我國(guó)東南 沿海及周邊地區(qū)均出現(xiàn)該病的流行，除了產(chǎn)蛋鴨和雞，碟、肉鴨和麻雀等均有感染報(bào)道，該 病已嚴(yán)重危害到我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
[0004] 產(chǎn)蛋下降綜合征病毒屬于禽腺病毒虹型的DNA病毒，是于1976年發(fā)現(xiàn)的引起家禽 W產(chǎn)蛋下降為特征的一種傳染病的病原，該病毒感染后主要引起雞群產(chǎn)蛋驟然下降，軟殼 蛋和崎形蛋增加等，故又命名為產(chǎn)蛋下降綜合征1976。不同年齡的雞和鴨均可感染，但幼齡 家禽不表現(xiàn)臨床癥狀。產(chǎn)蛋家禽感染該病毒后，開始發(fā)病時(shí)有或沒有一般性的下頻、食欲下 降和萎靡不振，隨后蛋殼稱色，接著泛起軟殼蛋、薄殼蛋。病程持續(xù)4~10周，產(chǎn)蛋下降幅度 達(dá)10%~40%，種蛋解化率降低，出殼后弱維增多，產(chǎn)蛋下降持續(xù)4~10周后一般可恢復(fù)正常。
[0005] 朋亞型禽流感病毒是正黏病毒科的RNA病毒，現(xiàn)有研究表明該病毒感染產(chǎn)蛋家禽 后同樣可引起家禽的產(chǎn)蛋率、受精率及解化率下降等危害。當(dāng)20~30周齡種禽感染時(shí)，會(huì) 出現(xiàn)的呼吸道癥狀，同時(shí)產(chǎn)蛋量出現(xiàn)群體性下降，4~5天內(nèi)產(chǎn)蛋量可下降30 %~70 %，部 分病例的產(chǎn)蛋禽甚至完全停止產(chǎn)蛋。4周后，產(chǎn)蛋禽緩慢恢復(fù)產(chǎn)蛋，但達(dá)不到感染前的水 平。
[0006] 連接酶依賴的PCR擴(kuò)增技術(shù)是一種基于連接酶的核酸PCR檢測(cè)技術(shù)，其工作原理 是:在一段人工合成的外源核酸序列的兩端連接與待檢病原核酸序列互補(bǔ)的寡核巧酸序列 作為捕獲探針，利用該捕獲探針與待測(cè)樣品中的病原核酸雜交，從而在待檢核酸鏈上形成 一個(gè)帶缺口的、首尾靠近的環(huán)，隨后在連接酶作用下將該環(huán)閉合形成一個(gè)完整的環(huán);最后用 針對(duì)該環(huán)外源核酸序列部分的特異性引物在DM聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到檢測(cè)待測(cè) 基因的目的。當(dāng)檢測(cè)多個(gè)目的核酸序列時(shí)，只需加入將各自特異性的捕獲探針進(jìn)行雜交，最 后用同一對(duì)檢測(cè)引物進(jìn)PCR擴(kuò)增，即可到達(dá)鑒別診斷的目的。因在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)及到探針環(huán) 化階段，故將該技術(shù)命名為環(huán)介導(dǎo)多重PCR。該技術(shù)不直接擴(kuò)增待檢核酸，而是通過(guò)擴(kuò)增與 待檢基因特異性雜交的外源基因來(lái)達(dá)到檢測(cè)待檢核酸的目的，既避免了檢測(cè)的非特異性， 又因減少了 PCR擴(kuò)增時(shí)的引物數(shù)量，使檢測(cè)效率和敏感性得到了保證。
[0007] 因此，根據(jù)連接酶依賴的PCR擴(kuò)增技術(shù)原理，建立一種可快速鑒別診斷禽坦布蘇病 毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、H9亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)多重PCR檢測(cè)方法作為產(chǎn)蛋家禽產(chǎn)蛋 下降病原的常規(guī)性檢測(cè)及疫病突發(fā)時(shí)病原的及時(shí)確診是十分有效的，為產(chǎn)蛋下降疫病病原 的早期診斷及防治措施的制定和執(zhí)行提供可靠的技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供產(chǎn)蛋下降重要病毒環(huán)介導(dǎo)多重PCR快速檢測(cè)引物。多重PCR方法是基于 連接酶的工作原理，用特異性的捕獲探針與對(duì)應(yīng)的病毒核酸雜交，并在連接酶作用下環(huán)化， 隨后應(yīng)用一對(duì)通用引物對(duì)環(huán)化的、針對(duì)不同病原的捕獲探針進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)獲得的擴(kuò)增產(chǎn) 物大小確定感染病原。
[0009] 所述連接酶是指DNA化q連接酶。
[0010] 3種引起產(chǎn)蛋禽產(chǎn)蛋下降重要病毒為產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽坦布蘇病毒及H9亞 型禽流感病毒，其特異性的捕獲探針序列分別如Seq ID No. l，Seq ID No.2和Seq ID No.3 所示。
[0011] 針對(duì)3種病毒核酸捕獲探針的通用檢測(cè)引物序列為：上游引物為5'- CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTT - 3'，下游引物為5'- CGAGGACGGCAGCGTGCAGCT - 3'。
[0012] 其檢測(cè)程序主要分3個(gè)階段，第一階段為變性階段，95°C維持5 min;第二階段為連 接酶介導(dǎo)的捕獲探針與模板的雜交及探針環(huán)化階段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min進(jìn) 行6個(gè)循環(huán);第Ξ階段為PCR檢測(cè)階段95°C 30 s，52°C~56°C 30 s，72°C 30 s進(jìn)行25個(gè) 循環(huán)，最后72 °C 10 min結(jié)束反應(yīng)。
[0013] 為獲得上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:依賴于連接酶的環(huán)介導(dǎo)多重PCR 擴(kuò)增方法，包括W下步驟： 1、病原核酸特異性探針的制備:根據(jù)GenBank中已發(fā)布的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的lOOkd 蛋白基因、禽坦布蘇病毒的衣殼蛋白基因及H9亞型禽流感病毒的血凝素蛋白基因保守區(qū)序 列保守區(qū)及增強(qiáng)型綠色巧光蛋白（EGFP)基因的部分序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物，運(yùn)3對(duì)引物的特征 在于5'端分別為W上3種病原核酸序列的互補(bǔ)寡核巧酸序列，3'端為外源基因（本發(fā)明中為 增強(qiáng)型綠色巧光蛋白基因）核酸序列。W綠色巧光蛋白質(zhì)粒作為模板，用運(yùn)3對(duì)引物分別進(jìn) 行常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得的巧巾擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后即可作為病毒核酸特異性捕獲探針。
[0014] 2、通用檢測(cè)引物的設(shè)計(jì):根據(jù)3種病原捕獲探針的共有序列（外源基因部分，即增 強(qiáng)型綠色巧光蛋白基因）設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物，該對(duì)引物的特征在于其與待檢測(cè)的病原目的 基因親緣關(guān)系遠(yuǎn)，特異性的與已環(huán)化的捕獲探針上的增強(qiáng)型綠色巧光蛋白基因雜交后，在 DNA聚合酶作用下啟動(dòng)PCR擴(kuò)增過(guò)程。
[0015] 3、環(huán)介導(dǎo)多重PCR檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化： (A)環(huán)介導(dǎo)多重PCR反應(yīng)體系的配置，所述環(huán)介導(dǎo)多重PCR反應(yīng)體系總計(jì)30 pL，包括 dNTPs 0.3 mM, lOXTaq DNA連接酶反應(yīng)緩沖液3化，Taq DNA連接酶0.5化，lOXTaq DAN聚合酶反應(yīng)緩沖液3 pL(含Mgh),化q DM聚合酶0.50 通用檢測(cè)引物各8 pmol, 巧中捕獲探針和DM或cDNA溶液各2 pL，加去離子水補(bǔ)足至30 pL，另外配置一份不含樣 品DNA或cDNA的反應(yīng)液做陰性對(duì)照。
[0016] (B)環(huán)介導(dǎo)多重PCR的反應(yīng)程序所有反應(yīng)均在同一個(gè)反應(yīng)管中完成，主要分3個(gè)階 段，第一階段為變性階段，95Γ維持5 min;第二階段為連接酶介導(dǎo)的捕獲探針與模板的雜 交及探針環(huán)化階段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min進(jìn)行6個(gè)循環(huán);第Ξ階段為PCR檢測(cè) 階段95°C 30 S, 52°C~56°C 30 S, 72°C 30 S進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72 °C 10 min結(jié)束反 應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行電泳顯示檢測(cè)結(jié)果。PCR檢測(cè)的特異性還可W通過(guò)將PCR產(chǎn)物純化 回收后送生