一種豬偽狂犬病病毒亞單位疫苗及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領域，具體設及豬偽狂犬病毒的亞單位疫苗及其制備方 法，W及用于制備預防和/或治療與豬偽狂犬病毒相關疾病和由豬偽狂犬病毒導致的感染 的組合物的應用。
【背景技術】
[0002] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由瘤疹病毒科化erpesviridae) a亞科中的豬 瘤疹病毒I型（Suid he巧esvirus Istrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生 動物的一種W發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。豬的偽狂犬病 在我國廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)?；i場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流 產(chǎn)、死胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻搏，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜 性及潛伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可W長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力 的病毒，被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0003] 本領域存在表達量高、有效免疫的抗偽狂犬病病毒感染的亞單位疫苗的現(xiàn)實需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首次通過將豬偽狂犬病毒濁蛋白取其片段進行融合表達，制備亞單位疫 苗，針對豬偽狂犬病毒引起的偽狂犬病有著較好的保護作用，而且意外發(fā)現(xiàn)，制備的濁蛋 白片段表達量顯著提高，大大降低了免疫成本。
[0005] 本發(fā)明的設及一種豬偽狂犬病病毒濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片 段，其中，所述濁蛋白片段能保持與所述濁蛋白的抗原活性；所述變異體或其活性片段的 氨基酸序列中與所述濁蛋白片段的氨基酸序列相比存在一個或多個保守性氨基酸替換、 添加或刪除而仍能保持與所述濁蛋白片段的抗原活性。
[0006] 本發(fā)明的另一方面設及編碼本發(fā)明所述豬偽狂犬病病毒濁蛋白片段、或其保守 性變異體或其活性片段的核巧酸序列。 陽007] 本發(fā)明的又一方面設及一種豬偽狂犬病病毒濁-曲蛋白，其中，所述濁-曲蛋白包 括本發(fā)明的所述的濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段W及曲蛋白。
[0008] 本發(fā)明的再一方面設及一種豬偽狂犬病病毒亞單位疫苗，其中，所述亞單位疫苗 包含免疫量的本發(fā)明的所述濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段和藥學上可接 受的載體。
[0009] 本發(fā)明還設及一種豬偽狂犬病病毒亞單位疫苗，其中，所述亞單位疫苗包含免疫 量的本發(fā)明的所述濁-曲蛋白片段和藥學上可接受的載體。
[0010] 本發(fā)明還設及一種制備亞單位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本發(fā)明 所述濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段的核巧酸序列的步驟；2)表達所述步驟 1)的克隆核巧酸序列的步驟，得到所述濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段，W 及3)使用所述步驟2)獲得的濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段，添加藥學上 可接受的載體W及佐劑，制備所述亞單位疫苗的步驟。
[0011] 本發(fā)明還設及一種制備亞單位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本發(fā)明 所述濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段的核巧酸序列，克隆所述曲蛋白核巧 酸序列的步驟；2)串聯(lián)表達或融合表達所述步驟1)的克隆核巧酸序列的步驟，得到所述 濁-曲蛋白，W及3)使用所述步驟2)獲得的濁-曲蛋白，添加藥學上可接受的載體W及佐 劑，制備所述亞單位疫苗的步驟。
[0012] 本發(fā)明還設及本發(fā)明所述的濁蛋白片段、或其保守性變異體或其活性片段、所述 的濁-曲蛋白、W及所述的豬偽狂犬病病毒亞單位疫苗在制備預防和/或治療豬偽狂犬病 病毒相關疾病或由豬偽狂犬病病毒導致的感染的藥物中的應用。
【附圖說明】 陽01引 圖1是豬偽狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株、Becker株濁蛋白的氨 基酸序列同源性比較，圖IA顯示各濁蛋白氨基酸序列1~約480位氨基酸殘基間序列的 比較，圖IB顯示各濁蛋白氨基酸序列約481位及剩余的氨基酸殘基間序列的比較。
[0014] 序列表中： 陽01引序列1為PRV HN1201株濁蛋白的核巧酸序列；
[0016] 序列2為PRV HNl201株濁蛋白的氨基酸序列； 陽017] 序列3為PRV HN1201株濁蛋白片段的核巧酸序列； 陽0化]序列4為PRV HN1201株濁蛋白片段的氨基酸序列；
[0019] 序列5為PRV Bartha株濁蛋白片段的核巧酸序列； W20] 序列6為PRV Bartha株濁蛋白片段的氨基酸序列；
[0021] 序列7為PRV Kaplan株濁蛋白片段的核巧酸序列；
[0022] 序列8為PRV Kaplan株濁蛋白片段的氨基酸序列；
[0023] 序列9為PRV Becker株濁蛋白片段的核巧酸序列； W24] 序列10為PRV Becker株濁蛋白片段的氨基酸序列； 陽02引序列11為PRV HN1201株曲蛋白的核巧酸序列；
[0026] 序列12為PRV HN1201株曲蛋白的氨基酸序列； W27] 序列13為PRV HN1201株濁蛋白片段和曲蛋白的融合蛋白核巧酸序列； 陽02引序列14為PRV HN1201株濁蛋白片段和曲蛋白的融合蛋白氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0029] W下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。
[0030] 術語"濁蛋白"又稱"濁糖蛋白"，在瘤疹病毒成員中屬于最保守的糖蛋白，其大小 約 2. m*。
[0031] 本發(fā)明的一個方面設及一種豬偽狂犬病病毒濁蛋白片段、或其保守性變異體或 其活性片段，其中，所述濁蛋白片段氨基酸包括位點W SEQ ID NO :2所示的豬偽狂犬病病 毒HN1201株濁蛋白序列為基準，濁蛋白約第62位至148位氨基酸所示序列和/或約第 546位至700位氨基酸所示序列，所述濁蛋白片段能保持與所述濁蛋白的抗原活性；所述 變異體或其活性片段的氨基酸序列中與所述濁蛋白片段的氨基酸序列相比存在一個或幾 個保守性氨基酸替換、添加或刪除而仍能保持與所述濁蛋白片段的抗原活性。
[0032] 不同豬偽狂犬病病毒株濁蛋白序列可能因氨基酸位點的插入、缺失，造成本發(fā)明 所述濁蛋白片段序列位置在不同豬偽狂犬病病毒株濁蛋白序列中存在差異，比如在豬偽 狂犬病病毒Bartha株對應氨基酸位置為濁蛋白第62位至150位W及第548位至702位， 在豬偽狂犬病病毒Kaplan株對應氨基酸位置為濁蛋白第62位至154位W及第552位至 706位，在豬偽狂犬病病毒Becker株對應氨基酸位置為濁蛋白第62位至147位W及第545 位至699位，其可通過與SEQ ID NO :2所示的豬偽狂犬病病毒HN1201株濁蛋白序列進行 比對，與豬偽狂犬病病毒HN1201株濁蛋白第62位至148位氨基酸所示序列W及第546位 至700位氨基酸所示序列對應的序列即為本發(fā)明所述濁蛋白片段序列。 陽03引濁蛋白片段的在濁蛋白序列上的氨基酸位點可通過DNAStar進行比對，W確定在 不同豬偽狂犬病病毒株中本發(fā)明所述的濁蛋白片段氨基酸序列對應的位點，通過比對豬 偽狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株和Becker株濁蛋白片段的氨基酸位點，結 果見圖1。也可通過其他的生物學軟件進行序列比對，W確定本發(fā)明所述的濁蛋白片段在 不同豬偽狂犬病病毒株中氨基酸位點，例如MEGA、DNAman、clustalX、bioedit、Vector NTI W及NCBI中的blast功能。
[0034] 本發(fā)明所用術語"保守性變異體"是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫 學生物特性、結構特性、調(diào)節(jié)特性或生化特性的變異體。一般的，多膚的保守性變異體的氨 基酸序列不同于母本多膚。但是差異是有限的，W使母本多膚序列與保守性變異體總體上 非常相似，并且在許多區(qū)域是相同的。保守性變異體和母本多膚氨基酸序列的差異可W是 例如：一個或幾個氨基酸殘基及其任一組合的替換、添加和刪除。替換或插入的氨基酸殘基 可由遺傳密碼編碼，也可由不遺傳密碼編碼。多膚的保守性變異體可W自然產(chǎn)生，或者它可 W是非自然產(chǎn)生的變異體。多膚非自然產(chǎn)生的保守性變異體可通過誘變技術或直接合成而 產(chǎn)生。
[0035] 本發(fā)明所述變異體或其活性片段的氨基酸序列中與所述濁蛋白片段的氨基酸序 列相比存在一個或幾個保守性氨基酸替換、添加或刪除而仍能保持與所述濁蛋白片段的 抗原活性，其中，所述一個或幾個保守性氨基酸替換、添加或刪除意指一個至10個保守性 氨基酸替換、添加或刪除，優(yōu)選一個至5個保守性氨基酸替換、添加或刪除。所述保守性氨 基酸替換、添加或刪除意指性質(zhì)相似、大小相當?shù)奶鎿Q、添加或刪除，包括但不限于甘氨酸 與丙氨酸之間的替換，絲氨酸與蘇氨酸之間的替換，精氨酸與賴氨酸之間的替換。
[0036] 作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明所述豬偽狂犬病病毒濁蛋白片段、或其保守 性變異體或其活性片段，其中，所述濁蛋白片段氨基酸包括位點W SEQ ID NO :2所示的豬 偽狂犬病病毒HN1201株濁蛋白序列為基準，濁蛋白第62位至148位氨基酸所示序列和/ 或第546位至700位氨基酸所示序列，所述濁蛋白片段能保持與所述濁蛋白的抗原活性； 所述變異體或其活性片段的氨基酸序列中與所述濁蛋白片段的氨基酸序列相比存在一個 或幾個保守性氨基酸替換、添加或刪除而仍能保持與所述濁蛋白片段的抗原活性。
[0037] 作為本發(fā)明的一種實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述濁蛋白片段來自 包括豬偽狂犬病病毒JS-2012株、豬偽狂犬HeNl株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和 NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJOl、豬偽狂犬病毒變異株HN1201 株、豬偽狂犬病毒變異株HN1202株、豬偽狂犬病病毒化株、豬偽狂犬病病毒Bartha株、豬 偽狂犬病病毒Kaplan株、豬偽狂犬病病毒Becker株。
[0038] 豬偽狂犬病病毒株JS-2012株公開于免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離 和鑒定[J].童武，張青占，鄭浩等，中國動物傳染病學報2013,21(3):1-7);豬偽狂 犬化Nl株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，其菌種保藏編 號為 CGMCCN0. 6656,公開于專利申請 CN102994458A ;NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株公開于 Pathogenic Pseudor油iesVirus, Xiuling 化，Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. China, 2012EmergingInfectious Diseases, www. cdc. gov/eid 0I.2O, No. I, January 2014 ;PRV TJ strain (PRV TJ)株，公開于 QiinaQum-Hua Wang Jin YuanI, Hua-Yang Qinl，et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV)provides rapid andcomplete protection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China Vaccine 32 (2014)3379 - 3385 中；豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJOI，其保藏號為CGMCCNo. 8170公開于CN103627678A ; 豬偽狂犬病毒 HN1201 株（Pseu