一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多環(huán)芳控(PA化)是受到廣泛關(guān)注的一類環(huán)境污染物質(zhì)，在環(huán)境中普遍存在且不斷 積累。菲(phenant虹ene)是一種S環(huán)芳控，它與PAHs的致癌性有著非常密切的關(guān)系，憑借其 獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，菲成為PAHs研究的模式化合物化i et al. ,2010;劉爽等，2013)。由于菲 具有持久性、致癌、致崎、致突變性及生物累積性等特性，能夠?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成 重大危害(楊軒等，2012)。
[0003] 環(huán)境中有毒有害有機(jī)污染物的自然衰減主要依賴相關(guān)微生物代謝作用，生物修復(fù) 技術(shù)具有成本低、效果好、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此該方法是目前菲污染修復(fù)最具潛力的修 復(fù)手段（Samanta et al.,1999;楊秀虹等，2012)。目前，已報(bào)道的菲降解菌株包括 Agmenellum sp.、Aeromonas sp.、Alcaligenes sp.、Acinetobacter sp.、Bacillus sp.、 Berjerincki曰 sp.、Burkholderi曰 sp.、Coryneb曰cterium sp.、Cyclotrophicus sp.、 Flavobacterium sp.、Micrococcus sp.、Moraxella sp.、Mycobacterium sp.、 Nocardioides sp.、Pseudomonas sp.、Lutibacterium sp.、Rhodococcus sp.、 Streptomyces sp.、Sphingomonas sp.、Stenotrophomonas sp.、Vibrio sp .、 Paenibacillus sp.等(Zhao et al.,2008)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外科研工作者已從自然環(huán)境中分 離得到一些菲降解菌，并對(duì)其降解性能進(jìn)行初步研究(侯寧等，2013)。倪雪等從多環(huán)芳控污 染區(qū)植物體內(nèi)分離得到兩株具有降解菲能力的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.)和 假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)，該兩株菌在7d內(nèi)可降解90 %無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的菲 (IOOmg . [1)(倪雪等，2013)。鄧軍等從長(zhǎng)期受PAHs污染的±壤中分離得到1株菲降解菌氧 化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)，在菲初始質(zhì)量濃度為50mg ? [1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng) 5d后，菲降解率為60%左右(鄧軍等，2010)。田志剛等從勝利油田附近石油污染±壤采集± 樣，篩選到能W菲為唯一碳源的芽抱桿菌屬，在菲初始濃度為200mg ? [1時(shí)，培養(yǎng)96h后的菲 降解率為98.36 % (田智剛等，2011)。目前，由于工礦業(yè)、農(nóng)業(yè)等人為活動(dòng)W及±壤環(huán)境背景 值高等因素已經(jīng)造成了環(huán)境中多環(huán)芳控的嚴(yán)重污染及嚴(yán)重超標(biāo)，并且化工類園區(qū)及周邊± 壤、采油區(qū)、采礦區(qū)、污水灌概區(qū)的主要污染物都為多環(huán)芳控巧Ij芳等，2011)。因此，篩選出 能有效降解高濃度菲的菌株更具應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5,該菌是 從山東北部某石油污水處理廠中采集活性污泥，W高濃度菲為碳源進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，通過多 次篩選和分離純化得到高效的、能降解高濃度菲的菲降解菌;Acinetobacter tandoii LJ-5于2016年3月1日保藏于廣東省微生物菌種保藏中屯、(GDMCC)，地址:廣州市先烈中路100號(hào) 大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生物研究所，保藏編號(hào)為:GDMCC No:60010。
[0005] 本發(fā)明的菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5的菌學(xué)特性描述如下：
[0006] 該菌經(jīng)活化W后，在3(TC有氧的條件下在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基制成的平板上生長(zhǎng)24h 后，能形成直徑為0.5-2.Omm灰白色、圓形、表面光滑、微微向上凸起的、不透明、邊緣整齊、 無(wú)芽抱、無(wú)鞭毛、革蘭氏染色呈陰性、菌株個(gè)體為桿狀的菌落。該菌為專性厭氧菌，其細(xì)胞尺 寸大概為0.7-1.0 X 1.0-1.5皿。其細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖見圖1。
[0007] 分子生物學(xué)特性:該菌的DNA G+C含量為41.0%，運(yùn)個(gè)含量正好落在已經(jīng)報(bào)道過的 不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌DNA G+C含量所在的范圍之內(nèi)；擴(kuò)增該菌的16s rRNA基因并測(cè)序，得到如 SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，利用該序列采用鄰位相接法和最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的 結(jié)果表明，該菌與Acinetobacter tandoii DSM 1497〇t同源性最高，達(dá)97.7% ;DNA-DNA雜 交實(shí)驗(yàn)表明該菌和Acinetobacter tandoii DSM 1497〇t雜交結(jié)果為90.11±0.8%，高于雜 交閥值70%，說明該菌在分子生物學(xué)層面上是屬于Acinetobacter tandoii同一個(gè)種的不 同株系，因此將本發(fā)明的菲降解菌LJ-5命名為Acinetobacter tandoii LJ-5。
[000引 Acinetobacter tandoii LJ-5應(yīng)用于菲降解的實(shí)驗(yàn)表明：在30°C，pH 7.0,不添加 化Cl的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，Acinetobacter tandoii LJ-5能夠很快地降解菲， 在菲初始濃度為100-200mg ? 1/1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，降解率均可達(dá)80% W上;在菲 的初始濃度在400-1000111肖-[1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，降解率均可達(dá)到60%^上;說明 Acinetobacter tandoii LJ-5是一種降解菲及耐受菲能力均很強(qiáng)的菌株。菲常常作為多環(huán) 芳控類的模式化合物，因此可W預(yù)見該菌對(duì)多環(huán)芳控具有較好的耐受性和降解性。因此，本 發(fā)明的第二個(gè)目的是提供菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5在降解多環(huán)芳控中的應(yīng) 用，進(jìn)一步的，菲降解菌Acinetobacter tandoii LJ-5在降解菲中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的Acinetobacter tandoii LJ-5是在活性污泥中分離并鑒定的新型不動(dòng) 桿菌屬的菌株，關(guān)于Acinetobacter tando i i對(duì)PAHs降解研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道； Acinetobacter tandoii LJ-5能W高濃度菲作為碳源從而有效降解，該菌在菲初始濃度為 50-200111旨-[1環(huán)境下培養(yǎng)3天后，降解率均可達(dá)80%^上;在菲的初始濃度為400-1000111邑-[1環(huán)境下培養(yǎng)7天后，降解率均可達(dá)到60% W上;該菌是一種降解菲及耐受菲能力均很強(qiáng)的 菌株，對(duì)多環(huán)芳控適應(yīng)性強(qiáng);在多環(huán)芳控污染環(huán)境的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。
[0010] 本發(fā)明的Acinetobacter 1:andoii LJ-5于2016年3月1日保藏于廣東省微生物菌 種保藏中屯、(GDMCC)，地址:廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生物研究所，保 藏編號(hào)為:GDMCC No:60010。
【附圖說明】
[0011]圖1是Acinetobacter tandoii LJ-5的形態(tài)，其中（a)為固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的 Acinetobacter tandoii LJ-5群落；（b)為Acinetobacter 1:andoii LJ-5透射電子顯微鏡 圖：無(wú)鞭毛，比例尺為0.5皿；（C)為Acinetobacter tandoii LJ-5透射電子顯微鏡圖，比例 尺為化m。
[0012] 圖2是利用鄰接法構(gòu)建的Acinetobacter tandoii LJ-5和其相關(guān)菌的基于16s rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，自展值設(shè)定重復(fù)1000次，圖中僅展示了自展值大于50%的 結(jié)果，比例尺0.Ol代表每個(gè)核巧酸的替換率，LJ-5T代表Acinetobacter tandoii LJ-5。
[0013] 圖3是利用最小進(jìn)化法構(gòu)建的Acinetobacter tandoii LJ-5和其相關(guān)菌的基于 16s rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，自展值設(shè)定重復(fù)1000次，圖中僅展示了自展值大于 50 %的結(jié)果，比例尺0.005代表每個(gè)核巧酸的替換率，LJ-5T代表Acinetobacter tandoi i U-5。
[0014] 圖4是不同生長(zhǎng)條件對(duì)Acinetobacter tandoii LJ-5的影響，其中（a)pH，（b)溫 度，（C)耐鹽度。
[0015] 圖5是Acinetobacter tandoii LJ-5在含不同濃度菲的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲 線，菲的初始濃度為IOO-1000 mg ? [1。
[0016] 圖6是Acinetobacter tandoii LJ-5在含不同濃度菲的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中菲降解情 況，菲的初始濃度為IOO-1000 mg ? [1。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[001引實(shí)施例1
[0019] 1材料
[0020] 1.1樣品來(lái)源
[0021] 從山東北部某石油污水處理廠中采集活性污泥，W高濃度菲為碳源進(jìn)行長(zhǎng)期馴 化，通過多次篩選和分離純化得到高效的菲降解菌LJ-5。
[0022] 1.2培養(yǎng)基
[0023] 1.2.1無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基
[0024] 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基用于樣品中微生物的富集培養(yǎng)和純菌條件下菲降解實(shí)驗(yàn)。該培養(yǎng)基 配方見表1(含菲溶液）。
[0025] 表1無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配方
[0026]
[0027] 1.2.2營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基
[0028] 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基化B培養(yǎng)基）用于細(xì)菌的分離、純化、保藏、活化等常規(guī)微生物的培養(yǎng)。 本實(shí)驗(yàn)所用的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基種類及成分見表2。若實(shí)驗(yàn)需要配制固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，僅需在 原有培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上增添1.5-2%的瓊脂粉。若菌株的培養(yǎng)條件無(wú)特別說明，培養(yǎng)基pH 均調(diào)節(jié)至7.2。
[0029] 表2營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分
[0030]
[00川巧法
[0032] 2.1菌株的馴化、篩選和分離
[0033] 將采集的活性污泥加入到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，W濃度為1000 mg ? [1的菲作為降解的 底物（即無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中含有1000 mg ? 1/1的菲），放置于30°C培養(yǎng)箱中避光震蕩培養(yǎng)。利用 W菲為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行菌株馴化，7d為一個(gè)馴化周期;取10%的接種量轉(zhuǎn)接到具 有相同培養(yǎng)體系的新鮮W菲為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中并重復(fù)上述富集過程，如此重復(fù)= 次。
[0034] 將上述獲得的第四代富集培養(yǎng)樣品W稀釋平板法進(jìn)行涂布分離，樣品用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基分離。將涂布好的樣品置于原培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)，經(jīng)過48小時(shí)左右，培養(yǎng)基表面形成明 顯的單菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)大小、顏色、透明度等特征挑取不相同的若干單菌落，并在營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)。若經(jīng)過劃線純化的平板上仍能觀察到不同特征的單 菌落，將其再次進(jìn)行劃線分離，直至在同一平板上只能觀察到相同特征的單菌落為止。實(shí)驗(yàn) 中篩選得到1株對(duì)菲有高效降解性能的菌株LJ-5。挑取純化后的LJ-5單菌落到相應(yīng)液體營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將菌液和無(wú)菌的甘油混合分裝至無(wú)菌的2ml凍存管中（甘油濃度 為15% )，放置于-80°C長(zhǎng)期保存。
[0035] 2.2菌株1尸5的形態(tài)特征
[0036] LJ-5是一株從活性污泥中分離出的細(xì)菌，經(jīng)活化W后，在30°C有氧的條件下在固 體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基制成的平板上生長(zhǎng)2地后，能形成直徑為0.5-2.Omm灰白色、圓形、表面光滑、 微微向上凸起的、不透明、邊緣整齊、無(wú)芽抱、無(wú)鞭毛、革蘭氏染色呈陰性、菌株個(gè)體為桿狀 的菌落。該菌為專性厭氧菌，其細(xì)胞尺寸大概為0.7-1.0 X 1.0-1.5皿。其細(xì)胞的透射電子顯 微鏡圖見圖1。
[0037] 2.3菌株1尸5的生理特征
[0038] 本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了許多LJ-5生理特性，運(yùn)些生理指標(biāo)主要是測(cè)定菌株LJ-