一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及添加劑的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]纖維素水解可得纖維低聚糖，纖維低聚糖在水中有一定的溶解度，在有機(jī)溶劑中微溶或者不容，纖維低聚糖是功能性低聚糖，可促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、為雙歧桿菌增殖因子、降低血清膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抵抗腫瘤等獨(dú)特的生理功能，是人、動(dòng)物、植物等具有特殊生理作用的低聚糖，可廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。
[0003]纖維素酶是一類能夠水解纖維素的β-l，4_葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱，傳統(tǒng)上傳統(tǒng)上將其分為3類:內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶在降解纖維素的過(guò)程中，纖維素酶組分中的葡萄糖苷酶主要在液相中發(fā)生作用，而水解得到的纖維低聚糖也主要溶解在液相中，葡萄糖苷酶會(huì)進(jìn)一步水解纖維低聚糖，釋放出葡萄糖作為產(chǎn)物。
[0004]目前，采用里氏木霉纖維素酶應(yīng)用于降解纖維素制備纖維低聚糖，盡管里氏木霉纖維素酶系中的葡萄糖苷酶活力較低，但是產(chǎn)物中葡萄糖含量依然很高，需要將其中的葡萄糖苷酶組分分離除去，以減少或消除葡萄糖苷酶對(duì)生成的纖維低聚糖進(jìn)一步降解。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，從里氏木霉纖維素酶系中分離除去β_葡萄糖苷酶的一個(gè)較好的方法是應(yīng)用層析分離法，但是層析分離法成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，因此尋找經(jīng)濟(jì)可行的、可工業(yè)化的一種低葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，是十分必要的。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低β_葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，其旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中纖維素酶降解纖維素得到纖維低聚糖的產(chǎn)量較低，且應(yīng)用層析分離法去除葡萄糖苷酶成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)問(wèn)題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種低β_葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，包括如下步驟:
[0008]步驟一、選取菌種:選取木霉屬中的里氏木霉作為生產(chǎn)纖維素酶的菌株；
[0009]步驟二、制備斜面孢子:將選取的里氏木霉接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，并置于生化培養(yǎng)箱中，在溫度為24?30°C、相對(duì)濕度為95?97%的恒溫恒濕暗環(huán)境下培養(yǎng)5?7天，直至里氏木霉菌絲表面形成一層分生孢子層，于4°C溫度下保存?zhèn)溆茫?br>[0010]步驟三、制備孢子懸液:用無(wú)菌水洗下步驟二處理得到的分生孢子，并稀釋孢子濃度至18個(gè)/mL，備用；
[0011]步驟四、制備種子液:在250mL的三角瓶中裝入50mL液態(tài)種子培養(yǎng)基，并用紗布封口，滅菌處理后，在無(wú)菌環(huán)境中取ImL經(jīng)步驟三得到的孢子懸液接種至液態(tài)種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)2?3天，使孢子萌發(fā)得到纖維素酶種子液，備用；
[0012]步驟五、制備發(fā)酵料:將秸桿、稻草、麥麩等纖維原料粉碎至20目以下，預(yù)處理并滅菌處理后冷卻，得到無(wú)菌發(fā)酵料；
[0013]步驟六、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng):將步驟四得到的種子液與步驟五得到的無(wú)菌發(fā)酵料以質(zhì)量比為1:10?12的比例均勻接種至液體培養(yǎng)基中，接種量為4?5%，并按照50?60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始PH值控制在4?7、溫度控制在28?32°C進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶處理，發(fā)酵時(shí)間為72?96小時(shí)；
[0014]步驟七、制備纖維素酶液:將經(jīng)過(guò)步驟六處理得到的發(fā)酵液在離心機(jī)中離心處理，得到纖維素酶液，備用；
[0015]步驟八、吸附脫附處理:取經(jīng)步驟七得到的纖維素酶液與纖維吸附基質(zhì)以一定的比例混合加入離心機(jī)中，并加入2?4倍水靜置，靜置一段時(shí)間后，開啟離心機(jī)離心脫附處理，去除液相中的葡萄糖苷酶；
[0016]步驟九、后處理:取出經(jīng)步驟八處理后的離心機(jī)中的低β-葡萄糖苷酶的物料，可直接用作綠色飼料添加劑進(jìn)行飼喂，纖維低聚糖含量高。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟二中的TOA固體培養(yǎng)基的制備方法:新鮮去皮馬鈴薯200g，切小塊，加蒸餾水至lOOOmL，沸水煮30min后用紗布過(guò)濾，添加葡萄糖20g、瓊脂粉18?20g，加熱至瓊脂溶化后加蒸餾水至100mU分裝至無(wú)菌試管中，于121°C溫度下滅菌30min，傾斜靜置，凝固后備用。
[0018]作為優(yōu)選，所述的步驟四中的恒溫培養(yǎng)振蕩器的溫度設(shè)定在24?32°C，旋轉(zhuǎn)頻率為180?260r/min。
[0019]作為優(yōu)選，所述的步驟六發(fā)酵過(guò)程中從發(fā)酵罐底部通入凈化后的無(wú)菌空氣，進(jìn)行氣流攪拌。
[0020]作為優(yōu)選，所述的步驟六中接種量為4%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時(shí)間為96小時(shí)。
[0021]作為優(yōu)選，所述的步驟六中接種量為5%，發(fā)酵溫度為32°C，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)。
[0022]作為優(yōu)選，所述的步驟八中的纖維吸附基質(zhì)包括低聚木糖生產(chǎn)廢渣。
[0023]作為優(yōu)選，所述的步驟八中離心機(jī)內(nèi)的溫度為10°C，pH值為7.0，靜置時(shí)間為30mino
[0024]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種低β-葡萄糖苷酶活力纖維素酶的制備方法，采用里氏木霉生產(chǎn)制備纖維素酶，其中的葡萄糖苷酶活性較低，減緩了葡萄糖苷酶對(duì)纖維素的進(jìn)一步降解作用，防止生成的纖維低聚糖進(jìn)一步被降解成葡萄糖，采用液態(tài)深層發(fā)酵法生產(chǎn)，具有培養(yǎng)條件容易控制、不易染雜菌、生產(chǎn)效率高的特點(diǎn)，可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，改善了目前國(guó)內(nèi)絕大部分纖維素生產(chǎn)廠家均采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，發(fā)酵水平不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)的現(xiàn)狀，采用低聚木糖生產(chǎn)廢渣等作為纖維吸附基質(zhì)，資源利用率高，并通過(guò)吸附脫附處理后，拆分去除溶于液相中的葡萄糖苷酶，進(jìn)一步降低了纖維素酶中葡萄糖苷酶的含量，且吸附的脫附處理的溫度為10°C，pH值為7.0，靜置吸附時(shí)間為30min，大大提高了內(nèi)切葡聚糖酶吸附率與β-葡萄糖苷酶吸附率的比值，提高了飼料中纖維低聚糖的含量。
[0025]本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。【【附圖說(shuō)明】】
[0026]圖1是溫度對(duì)低聚木糖生產(chǎn)廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖；
[0027]圖2是pH對(duì)低聚木糖生產(chǎn)廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖；
[0028]圖3是時(shí)間對(duì)低聚木糖生產(chǎn)廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖。
【【具體實(shí)施方式】】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面通過(guò)附圖中及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但是應(yīng)該理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說(shuō)明中，省略了對(duì)公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例提供一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，包括如下步驟:
[0031]步驟一、選取菌種:選取木霉屬中的里氏木霉作為生產(chǎn)纖維素酶的菌株。
[0032]步驟二、制備斜面孢子:將選取的里氏木霉接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，并置于生化培養(yǎng)箱中，在溫度為24?30°C、相對(duì)濕度為95?97%的恒溫恒濕暗環(huán)境下培養(yǎng)5?7天，直至里氏木霉菌絲表面形成一層分生孢子層，于4°C溫度下保存?zhèn)溆谩?br>[0033]其中，PDA固體培養(yǎng)基的制備方法:新鮮去皮馬鈴薯200g，切小塊，加蒸餾水至100mU沸水煮30min后用紗布過(guò)濾，添加葡萄糖20g、瓊脂粉18?20g，加熱至瓊脂溶化后加蒸饋水至lOOOmL，分裝至無(wú)菌試管中，于121°C溫度下滅菌30min，傾斜靜置，凝固后備用。
[0034]步驟三、制備孢子懸液:用無(wú)菌水洗下步驟二處理得到的分生孢子，并稀釋孢子濃度至108個(gè)/mL，備用。
[0035]步驟四、制備種子液:在250mL的三角瓶中裝入50mL液態(tài)種子培養(yǎng)基，并用紗布封口，滅菌處理后，在無(wú)菌環(huán)境中取ImL經(jīng)步驟三得到的孢子懸液接種至液態(tài)種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)2?3天，使孢子萌發(fā)得到纖維素酶種子液，備用。
[0036]其中，恒溫培養(yǎng)振蕩器的溫度設(shè)定在24?32°C，旋轉(zhuǎn)頻率為180?260r/min。
[0037]步驟五、制備發(fā)酵料:將秸桿、稻草、麥麩等纖維原料粉碎至20目以下，預(yù)處理并滅菌處理后冷卻，得到無(wú)菌發(fā)酵料。
[0038]步驟六、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng):將步驟四得到的種子液與步驟五得到的無(wú)菌發(fā)酵料以質(zhì)量比為1:10?12的比例均勻接種至液體培養(yǎng)基中，接種量為4?5%，并按照50?60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始PH值控制在4?7、溫度控制在28?