克隆甘薯羽狀斑駁病毒o株系和甘薯病毒c全長基因組序列的引物及克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系全長基因組序列的引物及克隆方法，克 隆甘馨病毒C全長基因組序列的引物及克隆方法和同時(shí)克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系和甘 馨病毒C全長基因組序列的引物及克隆方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘馨羽狀斑駁病毒（Sweet po1:ato featheiy mottle virus,SPFMV)和甘馨病毒C (Sweet potato virus C，SPVC)是危害甘馨的主要病毒，兩種病毒均屬于馬鈴馨Y病毒科 (化tyviridae)馬鈴馨Y病毒屬(Potyvirus)成員，田間常?；旌锨秩靖受埃⑶铱膳c甘馨稱 綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)協(xié)生引起甘馨復(fù)合病毒病 SPVD(sweet po1:ato virus disease,SPVD)的發(fā)生，造成甘馨產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)變劣和種 性退化，對甘馨生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。
[0003] 克隆病毒基因組的全長基因組序列，能夠進(jìn)一步研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能， 有助于探索更有效的抗病毒基因工程途徑。但是由于SPFMV和SPVC常混合侵染甘馨，分離純 化極為困難，而且兩種病毒在甘馨體內(nèi)含量較低，因此利用純化病毒的常規(guī)克隆方法很難 獲得病毒全長基因組序列。截止目前，尚未見SPFMV和SPVC中國分離物全長基因組序列的報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系和甘馨病毒C全 長基因組序列的引物，分別為克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系引物、克隆甘馨病毒C全長基因 組序列的引物和同時(shí)克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系和甘馨病毒C全長基因組序列的引物，同 時(shí)還提供相應(yīng)的克隆方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)利用純化病毒的常規(guī)克隆方法很難獲得病毒全 長基因組序列的技術(shù)問題。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株 系全長基因組序列的引物，包括S對引物，分別為引物對I-F和4711-R、引物對4689-F和 10380-R、引物對SPFMV-0-4160-F和SPFMV-0-5284-R，具體的核巧酸序列如下：
[0006] I-F:5 '-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3，
[0007] 4711-R:5 '-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3 '
[0008] 4689-F:5 '-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3 '
[0009] 10380-R:5 '-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3 '
[0010] SPFMV-0-4160-F:5 '-AAGCGACAGAGCAACAGACTTATGTACTA-3 '
[0011] SPFMV-0-5284-R:5 '-GATATTGCGTTGTAAATTCAACCTCACGTC-3 '
[0012] 其中，W=A或 T，Y = C或 T，R=A或 G，S = C或 G。
[0013] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系全長基因 組序列的方法，包括W下步驟：
[0014] (1)提取同時(shí)感染甘馨羽狀斑駁病毒、甘馨病毒C和甘馨稱綠矮化病毒的甘馨植株 葉片的總RNA，作為反轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0015] (2) W步驟（1)得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用引物對I-F和4711-R、引物對 4689-F和 10380-R、引物對SPFMV-0-4160-F和SPFMV-0-5284-R，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對應(yīng)的預(yù) 期擴(kuò)增片段大小分別為片段1 4.7化、片段2 5.7化和片段3 1.2化；
[0016] (3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合預(yù)期擴(kuò)增片段大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行回收純化，分別與PMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，將大腸桿菌TGl菌 液PCR鑒定獲得陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序和比對分析，得到包含甘馨羽狀斑駁病毒0 株系的基因組序列的片段1、片段2和片段3;拼接，得到甘馨羽狀斑駁病毒0株系的全長基因 組序列。
[0017]步驟（1)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為1〇41，包括：總3酷5.75化、5乂1^8證'6'化1、10^ mol/L的Oligo 肌引物0.扣L、10mmol/L的dNTPs liiL、40UAU的RNase抑制劑0.25化和抓AU 的AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.化L。
[0018] 反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄60min，99°C5min，5°C5min。
[0019] 步驟(2)中PCR的反應(yīng)體系為50山，包括：10XPCR Buffer 5化、2.5mmol/L的dNTPs 4化、lOwnol/L的上下游引物各1化、5U/化的LA Taq酶0.扣U反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.化1，余量為 d 地 2〇。
[0020] PCR的反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5min; 94 °C變性30s，55 °C退火30s，根據(jù)目的條帶大 小，按照化b/min計(jì)算延伸時(shí)間，72°C延伸l-6min，完成35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0021] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供克隆甘馨病毒C全長基因組序列的引物，包 括S對引物，分別為引物對I-F和4711-R、引物對4689-F和10380-R、引物對SPVC-41IO-F和 SPVC-5209-R，具體的核巧酸序列如下：
[002。 1-F:5 '-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3，
[0023] 4711-R:5 '-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3 '
[0024] 4689-F:5 '-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3 '
[0025] 10380-R:5 '-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3 '
[0026] SPVC-41IO-F:5 '-ACTGCATTACACACAAAGAGTGTAGCATTG-3 '
[0027] SPVC-5209-R:5 '-ATGATGAATTCATATTCGCGTAACTGCTCAG-3 '
[002引 其中，W=A或 T，Y = C或 T，R=A或 G，S = C或 G。
[0029] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種克隆甘馨病毒C全長基因組序列的方 法，包括W下步驟：
[0030] (1)提取同時(shí)感染甘馨羽狀斑駁病毒、甘馨病毒C和甘馨稱綠矮化病毒的甘馨植株 葉片的總RNA，作為反轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0031] (2) W步驟（1)得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用引物對I-F和4711-R、引物對 4689-F和10380-R、引物對SPVC-4110-F和SPVC-5209-R，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對應(yīng)的預(yù)期擴(kuò)增 片段大小分別為片段1 4.7化、片段2 5.7化和片段4 1.化b;
[0032] (3)用瓊脂糖凝膠電泳檢巧UPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合預(yù)期擴(kuò)增片段大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行回收純化，分別與PMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，將大腸桿菌TGl菌 液PCR鑒定獲得陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序和比對分析，得到包含甘馨病毒C的基因組 序列的片段1、片段2和片段4;拼接，得到甘馨病毒C的全長基因組序列。
[0033] 步驟（1)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為lOyl，包括:總RNA 5.75化、5XRT BufferfiiLlOy mol/L的Oligo 肌引物0.扣L、10mmol/L的dNTPs liiL、40UAU的RNase抑制劑0.25化和抓AU 的AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.化L。
[0034] 反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄60min，99°C5min，5°C5min。
[0035] 步驟(2)中PCR的反應(yīng)體系為50山，包括：10XPCR Buffer 5化、2.5mmol/L的dNTPs 4化、lOwnol/L的上下游引物各1化、5U/化的LA Taq酶0.扣U反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.化1，余量為 d 地 2〇。
[0036] PCR的反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5min; 94 °C變性30s，55 °C退火30s，根據(jù)目的條帶大 小，按照化b/min計(jì)算延伸時(shí)間，72°C延伸l-6min，完成35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0037] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供同時(shí)克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系和甘馨病 毒C全長基因組序列的引物，包括四對引物，分別為引物對I-F和4711-R、引物對4689-F和 10380-R、引物對SPFMV-0-4160-F和SPFMV-0-5284-R、引物對SPVC-41IO-F和SPVC-5209-R， 具體的核巧酸序列如下：
[003引 I-F:5 '-AATAACACAACWCAAYACAACAYAASAAAACT-3，
[0039] 4711-R:5 '-GTGATATCATCTAARCTYTGATG-3 '
[0040] 4689-F:5 '-CATCARAGYTTAGATGATATCAC-3 '
[0041 ] 10380-R:5 '-CATATCGCGCAAGACTCATATC-3 '
[0042] SPFMV-0-4160-F:5 '-AAGCGACAGAGCAACAGACTTATGTACTA-3 '
[0043] SPFMV-0-5284-R:5 '-GATATTGCGTTGTAAATTCAACCTCACGTC-3 '
[0044] SPVC-41IO-F:5 '-ACTGCATTACACACAAAGAGTGTAGCATTG-3 '
[0045] SPVC-5209-R:5 '-ATGATGAATTCATATTCGCGTAACTGCTCAG-3 '
[0046] 其中，W=A或 T，Y = C或 T，R=A或 G，S = C或 G。
[0047] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種同時(shí)克隆甘馨羽狀斑駁病毒0株系和甘 馨病毒C全長基因組序列的方法，包括W下步驟：
[0048] (1)提取同時(shí)感染甘馨羽狀斑駁病毒、甘馨病毒C和甘馨稱綠矮化病毒的甘馨植株 葉片的總RNA，作為反轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0049] (2)