一種局限青霉的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于噴氣燃料污染微生物檢測技術領域，具體設及一種檢測噴氣燃料中特 征真菌PeniclIium restrictum的方法。
【背景技術】
[0002] 有研究發(fā)現(xiàn)局限青霉(Penicllium restrictum)與儲備噴氣燃料中的懸浮物有 關，而懸浮物是影響噴氣燃料潔凈性的一個重要指標。實際油庫調查研究發(fā)現(xiàn)，被真菌污染 的噴氣燃料中發(fā)現(xiàn)了局限青霉(Penicllium res化ictum)的影子。局限青霉(Penicllium reShiCturn)是一種常見的絲狀真菌，屬于杯霉科(DiseeIlaceae )，青霉屬（Penicl 1 ium SP)。有研究發(fā)現(xiàn)局限青霉可W溶血素，對油庫工作人員的身體健康構成威脅。目前，國際航 空運輸協(xié)會(The International Air Transport Association,IATA)推薦了4種檢測方法 針對飛機油箱中的微生物，但是針對局限青霉(PeniclIium restrictum)特異性檢測的方 法沒有，MicrobMoiter2、Easicult Combi是一種運用培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物的定量評估方法， 耗時長，而且局限青霉（Penic 11 ium reStrictum)在普通培養(yǎng)基上生長具有局限性。 FUELSTAT? resinae是一種免疫檢測法，定性評估真菌污染情況，雖然檢測時間短但成本高 并且操作復雜。因此，有必要提供一種快速靈敏的檢測局限青霉(Penicllium restrictum) 新方法。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測噴氣燃料中特征性的真菌局限青霉 化eniclIi皿restrict皿)的方法，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種檢測真菌局限青霉(PeniclIium restrictum)的LAMP引物 組，包括有：
[0005] F3 引物A-F3:5' -AGGGATACCCGCTGAACTT-3' (SEQ ID NO: 1)、
[0006] B3引物A-B3:5'-TCCCATACGGGATTCTCACC-3'(沈Q ID N0:2)、
[0007] FIP引物A-FIP:5'-TTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCGGAGGAAAAGAAACCAAC-3'(SEQID N0:3)、
[0008] 61口引物八-81口：5'-八1'刊6〔八6八66八16(：1'1'〔666八1'圳八16八〔66〔〇：6刊〇：-3'(569 10 N0:4)、
[0009] LF引物A-LF:5'-GCCGTTACTGGGGCAATC-3'(沈Q ID N0:5)
[0010] LB引物A-LB:5'-GGCCCCCATCTAAGTGCT-3'(沈Q ID N0:6);
[00川作為優(yōu)選，A-FIP的序列如下：
[0012] 5'-TTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCGGAGGAAAAGAAACCAAC-3' (SEQ ID NO:7)、
[OOU] A-BIP的序列如下：
[0014] 5^ATTTGCAGAGGATGCTTCGGGATCTATGACGGCCCGTTCC-3^沈Q ID N0:8)。
[0015] 其中A-FIP為5/端進行生物素標記，A-LF的5/端進行異硫氯酸巧光素 FITC標記；
[0016] 本發(fā)明還提供一種檢測局限青霉(Penicllium res化ictum)的方法，包括如下的 步驟
[0017] 1)配制LAMP反應體系:各引物的終濃度為:各0.2皿ol/L的F3及B3，各1.6皿ol/L的 FIP及BIP，各0 .如mol/L的LF及LB，甜菜堿0.8mol/L，1.4mmol/L的dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，KC1 10mmol/L，MgS〇4 8mmol/L，Tween-20 0.1%，（NH4)2S04 10mmol/L，Bst DNA聚合酶8U，基因組DNA模板化L，超純水定容至2如レ
[0018] 2)LAMP反應體系擴增:將上述反應體系進行核酸擴增反應，擴增反應所需溫度為 6rC-65°C，擴增反應所需時間為30min-60min;
[0019] 3)L抑檢測：取祉L核酸擴增產物將產物加入到100化Buffer中混勻，然后將L抑試 紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測，通過試紙條判斷擴增結果；
[0020]其中步驟2中所述的最適反應溫度為65°C，最適反應時間為60min。
[0021 ] 本發(fā)明所提供的局限青霉(Penicllium restrictum)的LAMP-LFD檢測方法具有如 下優(yōu)點：
[0022] l)高靈敏度:對局限青霉(Peniclliumres1:;rictum)最低檢測線為4.2fg/lil，是 PCR 的 1000倍。
[00剖 2)特異性強：
[0024] 3)檢測時間較短：只需60min即可完成檢測，比PCR檢測快了進90min。
[0025] 4)儀器設備要求低，只需一個恒溫加熱器即可完成檢測，不需要PCR儀、電泳儀和 凝膠成像系統(tǒng)等。
[00%] 5)操作簡單、LFD直接將結果可視化，不許借助儀器。
[0027] 6)安全、可靠，相對PCR，擬棄了諸如邸等強毒性物質的使用。
[00巧]綜上所述，本發(fā)明LAMP-L抑方法檢測局限青霉(PeniclIium restrictum)相對于 傳統(tǒng)PCR方法，不僅做到了結果可視化，還具有特異性強、操作簡單、耗時短、靈敏度高W及 不依賴昂貴的特殊儀器的特點。運用本發(fā)明的方法對儲備中的噴氣燃料進行檢測，能更好 地提高了特征真菌污染噴氣燃料的預警能力，運對保障噴氣燃料質量及飛機的飛行安全有 著重要的意義。
【附圖說明】
[0029] 圖1:局限青霉18s基因的LAMP-LFD引物和探針設計示意圖，引物和探針由方框圈 出、
[0030] 圖2:PCR-AGE檢測局限青霉的靈敏度圖、
[0031] 圖3:LAMP-LFD檢測微局限青霉靈敏度圖、
[0032] 圖2和圖3中，泳道M為DL2000DNA marker，NC為陰性對照，1泳道為10〇(模板濃度 8.2ng/iiL)，2-9泳道依次為 1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6、1〇-7、IQ-S倍稀釋的基因組DNA。
[0033] 圖4:PCR-AGE檢測局限青霉的特異性圖、
[0034] 圖5: LAMP檢測局限青霉的特異性圖、
[0035] 圖6: LAMP-LFD檢測局限青霉的特異性圖；
[0036] 圖4、圖5和圖6中，泳道M為DL2000DNA marker,NC為陰性對照，1-8:局限青霉 (P.restrictum)、歧皺青霉(Penicillium stckii)、指狀青霉(Penicillium digitatum)、 靑狀曲霉(A.penicillioides)、Khuskia oryzae、枝胞霉菌(Cladosporium resinae)、綠色 木霉菌（Trichoderma viride)W及出芽短梗霉(Aureobasidi皿 pullulans)。
【具體實施方式】
[0037] LAMP-LFD技術是環(huán)介導橫溫擴增技術（Loop-med i a t ed i S O therma 1 amplification)與橫向流動試紙條(Lateral flow dipstick)相結合的一種新穎的微生物 檢測技術，該技術將核酸橫溫擴增和可視化試紙條檢測相結合。環(huán)介導等溫擴增技術 (LAMP),只需要在恒溫(60°C-65°C)條件下恒溫幾十分鐘，即可將所需目的基因擴增到1〇9 水平。橫向流動試紙條(LFD)，融合了免疫層析技術和分子生物學手段，可特異性地檢測出 該目標產物。環(huán)介導橫溫擴增技術(LAMP)與橫向流動試紙條(L抑)相互結合的技術，使LAMP 擴增產物現(xiàn)場檢測得W實現(xiàn)，檢測結果明顯直觀，可視化。LAMP-LFD方法具有安全、快捷、高 效、高靈敏度、高特異性且儀器依賴程度低，具有其他技術所無法替代的優(yōu)勢。
[0038] 本發(fā)明分為W下S個部分：1、設計合成3對用于局限青霉(P.res化ic化m)的LAMP 擴增引物，即A-F3和A-B3、A-FIP和A-BIP W及A-LF和A-LB，長度分別為20bp、19bp、40bp、 39bp、2化P和22bp的寡核巧酸序列；2、配制LAMP反應體系，通過LAMP反應程序對樣品模板進 行擴增，確定最佳的反應體系和反應條件;3、將A-LF設計為DNA探針，結合LFD技術對LAMP擴 增結果進行分析
[0039] W下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述
[0040] 歧皺青霉(Penicillium stckii)、指狀青霉(Penicillium digitatum)、靑狀曲霉 (Aspergillus penicillioides CICC2153)、枝胞霉菌(Cladosporium resinae)、局限青霉 化enicllium restrictum CICC40688)、綠色木霉菌（Trichoderma viride CGMCC3.3875)、 出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans CGMCC3.2942)W 及 Khuskia oryzae (CGMCC3.8851 )，除枝抱霉為實驗室從噴氣燃料中分離保存之外，其余皆由中國工業(yè)微生物 保藏管理中屯、(CICC) W及中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(CGMCC)提供。 W上菌種均選用沙保氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于搖床培養(yǎng)4d，溫度為25°C。沙保氏液體培養(yǎng) 基的制備簡述:?葡萄糖、Ig蛋白腺加入IOOmL的去離子水中混勻，125°C高壓滅菌20min，膽 存?zhèn)溆谩?br>[0041 ]實施例1 = LAMP-LFD技術檢測噴氣燃料中污染真菌局限青霉的方法建立 [0042] 1.1材料與方法
[00創(chuàng) 1.1.1材料
[0044] !"akara Mini肥ST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.50購置寶生物 工程化連巧限公司脫氧核糖核酸擴增試劑盒，榮研生物科技（中國巧限公司，LFD檢測試 紙條購自Milenia Biotec GmbH公司（Milenia GenLine HybriDetect MG皿 1 ,Germany)
[0045] 1.1.2 方法
[0046] 1.1.2.1 LAMP