[0101] 實(shí)施例5實(shí)時(shí)RT-PCR檢測
[0102] 如實(shí)施例4所述，將構(gòu)建的Lenti-ShRNA-R-Spondinl慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì) 胞LX2,Real-time PCR檢測LX2中R-Spondinl和肝纖維化標(biāo)志物a-SMAXollagen-U^mRNA 水平。1)PCR引物如下所示 [01031
[010 引 2)Trizol 法提取總 RNA，-80°C 保存；
[0106] 3)紫外分光光度計(jì)測定260皿和280皿波長處的吸光度值，計(jì)算提取的總RNA濃度； 4)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA后，-20°C保存；
[0107] 后欣化累九，
[010 引
[0109] 在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；
[0110] 6沖〇?條件:951：4分鐘，1個(gè)循環(huán);951：30秒，601：45秒，72°(：1分鐘，共35個(gè)循 環(huán);72 °C延伸5分鐘；
[0111] 7)用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用比較Ct值的方法分析結(jié)果，目的基因的表達(dá)量由0-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0112] Real-time PCR檢測顯不，與對照組相比，Lenti-shRNA-R-Spondinl顯著下調(diào)人肝 星狀細(xì)胞LX2中的R-SpondinU參見圖2)和肝纖維化標(biāo)志物a-SMA、Collagen-I(參見圖4)的 mRNA水平。表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的RNA干擾片段沉默了 R-Spondinl祀基因的表達(dá)，從而抑制肝 星狀細(xì)胞的激活。
[0113] 實(shí)施例6 Western blot檢測
[0114] 如實(shí)施例4所述，將構(gòu)建的Lenti-shRNA-R-Spondinl慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì) 胞LX2,Western blot法檢測LX2中R-Spondinl蛋白和肝纖維化標(biāo)志物a-SMA、ColIagen-I蛋 白的表達(dá)。
[0115] DRIPA裂解液提取人肝星狀細(xì)胞LX2的總蛋白；
[0116] 2)用酶標(biāo)儀測定562nm波長處各孔的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度；
[0117] 3)聚丙締酷胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，分別加入R-Spondinl抗 體（1:1000)、日-5魁抗體（1:300)和(：〇11日邑6111抗體（1:1000)，4°(：解育過夜；
[011引 4)洗膜后加入二抗(1:2000)，室溫解育2小時(shí)后電化學(xué)發(fā)光試劑檢測；
[0119] 5)e-actin蛋白為內(nèi)參照，凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司）對各條帶的灰度 值進(jìn)行分析。
[0120] Western blot法檢測顯示，與對照組相比，Lenti-shRNA-R-Spondinl顯著下調(diào)人 肝星狀細(xì)胞LX2中的R-Spondin 1蛋白（參見圖2)和肝纖維化標(biāo)志物a-SMA蛋白、Co 1 Iagen-I 蛋白（參見圖4)的表達(dá)。表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的RNA干擾片段下調(diào)了R-Spondinl祀基因的表 達(dá)，從而抑制的肝星狀細(xì)胞的激活。
[0121] 實(shí)施例7免疫巧光檢測
[0122] 如實(shí)施例4所述，將構(gòu)建的Lenti-shRNA-R-Spondinl慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì) 胞LX2,免疫巧光法檢測LX2中R-Spondinl蛋白和肝纖維化標(biāo)志物a-SMA的表達(dá)。
[0123] 1)對慢病毒轉(zhuǎn)染的人肝星狀細(xì)胞LX2，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每 次10分鐘，然后用4%多聚甲醒在室溫條件下固定細(xì)胞15分鐘；
[0124] 2)PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10分鐘，然后在4°C條件下，用0.1 %化iton X-IOO透膜15 分鐘；
[0125] 3)PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10分鐘，然后在室溫條件下，用4%BSA封閉細(xì)胞30分鐘；
[01%] 4)按1:100的比例分別稀釋各一抗(R-Spondinl和a-SMA)，然后將其放在4°C冰箱 中解育過夜；
[0127] 5) PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10分鐘，按1:100的比例稀釋相應(yīng)二抗，37 °C條件下放置1 小時(shí)；
[012引6)用PBS沖洗3次，每次10分鐘，最后DAPI染細(xì)胞核并用巧光顯微鏡拍照。
[0129] 免疫巧光顯示(參見圖3)，與對照組相比，Lenti-shRNA-R-Spondinl明顯降低了人 肝星狀細(xì)胞LX2中R-Spondinl蛋白和a-SMA蛋白的表達(dá)。表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的RNA干擾片段 下調(diào)了 R-Spondinl祀基因的表達(dá)，從而抑制了肝星狀細(xì)胞的肝纖維化發(fā)展。
[0130] 實(shí)施例8油紅0染色檢測
[0131] 如實(shí)施例4所述，將構(gòu)建的Lenti-shRNA-R-Spondinl慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì) 胞LX2，油紅0染色法檢測LX2中油脂的儲存狀況。
[0132] 1.染料的配制
[0133] Oil Red 0 0.5g溶于100mL異丙醇。
[0134] 2.染色步驟
[0135] 1)稀釋，染料同蒸饋水按3:2稀釋；
[0136] 2)過濾，通過定性濾紙過濾；
[0137] 3)固定，吸棄培養(yǎng)液后加入固定液5分鐘；
[0138] 4)吸棄固定液，加入染色液15分鐘后水洗一次鏡檢觀察；
[0139] 5)蘇木晶復(fù)染；
[0140] 6)水沖洗至變藍(lán)后觀察并拍照。
[0141 ] 油紅0染色顯示（參見圖5)，與對照組相比，Lenti-shRNA-R-Spondinl明顯增強(qiáng)了 人肝星狀細(xì)胞LX2中油脂的存儲。表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的RNA干擾片段抑制了 R-Spondinl祀基 因的表達(dá)，從而促使激活的肝星狀細(xì)胞向靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化。
[0142] 實(shí)施例9 MTT增殖檢測
[0143] 如實(shí)施例4所述，將構(gòu)建的Lenti-shRNA-R-Spondinl慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì) 胞LX2，MlT法檢測LX2的增殖情況。
[0144] 1)人肝星狀細(xì)胞LX2接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞密度為4 X IO3;
[0145] 2)如實(shí)施例4所述，轉(zhuǎn)染Lenti-shRNA-R-Spondinl慢病毒載體；
[0146] 3)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，每孔加入10化MTT液體；
[0147] 4)37°C解育4小時(shí)，每孔加入10化L DMSO，充分搖勻；
[0148] 5)用酶標(biāo)儀，W570nm的波長進(jìn)行吸光度檢測，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0149] MTT增殖檢測顯示（參見圖5)，與對照組相比，Lenti-shRNA-R-Spondinl明顯降低 了人肝星狀細(xì)胞LX2的增殖。表明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的RNA干擾片段抑制了 R-Spondinl祀基因的 表達(dá)，從而抑制了肝星狀細(xì)胞的增殖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對哺乳動(dòng)物R-Spondinl基因靶點(diǎn)的小干擾RNA，所述小干擾RNA包含 正義鏈和反義鏈，其特征在于其中： 正義鏈序列為5'-GCCAUAACUUCUGCACCAA-3'，如SEQ ID N0:1 所示； 反義鏈序列為5'-UUGGUGCAGAAGUUAUGGC-3'，如SEQ ID N0:2所示。2. 如權(quán)利要求1所述的小干擾RNA，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為人。3. -種如權(quán)利要求1所述的小干擾RNA的用途，其特征在于，所述的小干擾RNA通過化學(xué) 合成法合成短發(fā)卡RNA。4. 一種由權(quán)利要求1所述的小干擾RNA合成的短發(fā)卡RNA，所述短發(fā)卡RNA包含正義鏈和 反義鏈，其特征在于其中： 正義鏈序列為 5'-GATCCCCGCCATAACTTCTGCACCAATCAAGAGTTGGTGCAGAAGTTATGGCTTTTTTGGAAA-3'，如 SEQIDN0:3K*; 反義鏈序列為 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCCATAACTTCTGCACCAACTCTTGATTGGTGCAGAAGTTATGGCGGG-3'，如 SEQIDN0:4**。5. -種含有如權(quán)利要求4所述的短發(fā)卡RNA的載體，其特征在于，所述的短發(fā)卡RNA與病 毒表達(dá)載體或非病毒表達(dá)載體相連。6. 如權(quán)利要求5所述的載體，其所述病毒表達(dá)載體為慢病毒載體或腺病毒載體。7. 如權(quán)利要求5所述的載體，其所述非病毒表達(dá)載體為質(zhì)粒載體。8. 如權(quán)利要求5所述的含有短發(fā)卡RNA的載體在制備肝纖維化基因治療藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了針對哺乳動(dòng)物R-Spondin1基因靶點(diǎn)的小干擾RNA、短發(fā)卡RNA及載體和應(yīng)用。所述小干擾RNA包含正義鏈和反義鏈。基于該小干擾RNA可通過化學(xué)合成法合成短發(fā)卡RNA。短發(fā)卡RNA可進(jìn)一步與病毒表達(dá)載體或非病毒表達(dá)載體相連，形成一種針對哺乳動(dòng)物R-Spondin1基因靶點(diǎn)的載體。其中病毒表達(dá)載體為慢病毒載體或腺病毒載體，非病毒表達(dá)載體為質(zhì)粒載體。上述的短發(fā)卡RNA的載體可用于制備肝纖維化基因治療藥物。本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對R-Spondin1基因靶點(diǎn)的RNA干擾片段能促使激活的肝星狀細(xì)胞回退到靜止?fàn)顟B(tài)或凋亡，從而有效促進(jìn)肝纖維化的恢復(fù)過程。
【IPC分類】C12N15/113, A61K48/00, A61K31/713, C12N15/85, A61P1/16
【公開號】CN105695465
【申請?zhí)枴緾N201610163710
【發(fā)明人】虞玲華, 殷新光
【申請人】嘉興市第一醫(yī)院
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年3月19日