去除b8r和a47l的重組痘苗病毒及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程及生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種去除B8R和A4化的 重組痘苗病毒，本發(fā)明還設(shè)及該重組痘苗病毒的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因重組技術(shù)的發(fā)展為疫苗的研發(fā)提供了一個(gè)有效的手段。W活病毒為載體，插 入外源性目的基因的重組疫苗(recombinant vaccine)，占到為數(shù)眾多的基因治療研究的 70%W 上。
[0003] 天花是迄今為止人類利用疫苗運(yùn)一免疫手段成功根除的唯一一種感染性疾病。痘 苗病毒(vaccinia virus)作為人類預(yù)防天花的疫苗，在根除天花中發(fā)揮了重要的作用。
[0004] 痘苗病毒是一類病毒粒最大的雙鏈DNA病毒，與天花病毒同屬痘病毒科正痘病毒 屬(Poxvirus)。由于在天花免疫預(yù)防中的成功應(yīng)用，痘苗病毒被當(dāng)做衡量一個(gè)疫苗有效與 否的"金標(biāo)準(zhǔn)"。痘苗病毒被廣泛應(yīng)用于人類長(zhǎng)達(dá)一個(gè)多世紀(jì)，在人體的安全性和有效性已 得到充分的證明。因而，痘苗病毒是最早被用做疫苗載體的病毒。由于在消除天花中的成功 應(yīng)用，痘苗病毒被認(rèn)為是疫苗和其他生物治療藥物的理想載體。痘苗病毒作為疫苗及生物 技術(shù)藥物的載體，與其他載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、人單純瘤疹病毒、腺病毒、及某些細(xì)菌)相比 較，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括：1)載體基因組大，可插入較大的外源基因而不改變其生物學(xué)特性 和感染性;2)重組病毒構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單，易于構(gòu)建多價(jià)疫苗;3)依靠自身啟動(dòng)子，能夠高效表 達(dá)外源蛋白，有效地加工表達(dá)產(chǎn)物，刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng);4)接種方便;5)易于生 產(chǎn);6)凍干保存效價(jià)穩(wěn)定。
[0005] 目前國(guó)際上有多家生物公司和研究小組進(jìn)行W痘苗病毒為載體的疫苗和其他生 物技術(shù)藥物的研發(fā)，基本技術(shù)方案均為去除痘苗病毒不同區(qū)段的基因（如TK)，并插入外源 目的基因。上述產(chǎn)品有些已經(jīng)進(jìn)入II期臨床。國(guó)內(nèi)也有研究小組進(jìn)行上述工作，但為數(shù)不 多。痘苗病毒作為疫苗或藥物的載體，一個(gè)顯著的問(wèn)題是痘苗病毒自身具有較強(qiáng)的免疫優(yōu) 勢(shì)，使得外源性抗原的表達(dá)和免疫原性較弱。而目前W活痘苗病毒為載體的疫苗和生物技 術(shù)藥物均未對(duì)載體的免疫優(yōu)勢(shì)進(jìn)行削弱，極大地制約了疫苗的有效性。另一方面，雖然痘苗 病毒作為疫苗在大量人群中長(zhǎng)期使用，其安全性得到了充分的肯定，但是痘苗病毒接種后 仍會(huì)在少數(shù)個(gè)體中產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，尤其在一些免疫功能低下的特定人群中更易出現(xiàn)， 包括局部甚至全身性瘤疹，及較為罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。目前國(guó)內(nèi)外與本發(fā)明相似的現(xiàn)有 技術(shù)方案均未考慮提高痘苗病毒的安全性。
[0006] 研究表明B8R和A4化均為痘苗病毒免疫優(yōu)勢(shì)最強(qiáng)的抗原表位之一，去除B8R和A4化 可顯著降低痘苗病毒自身的免疫優(yōu)勢(shì)，從而提高外源性目的抗原的免疫原性。同時(shí)，B8R基 因編碼蛋白是一種干擾素丫（IFN-丫）的特異性受體，IFN-丫作為重要的免疫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)因 子在一系列免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用;B8R的缺失可降低痘苗病毒的毒力，并對(duì)機(jī)體的抗 病毒免疫造成影響。A4化是痘苗病毒上的一種重要的激活殺傷性T細(xì)胞的抗原表位，在痘苗 病毒感染中高轉(zhuǎn)錄高表達(dá)，在正痘病毒中高度保守，而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。 研究未發(fā)現(xiàn)B8R和A4化具備痘苗病毒生長(zhǎng)和復(fù)制過(guò)程中所必需的功能，去除B8R和A4化對(duì)痘 苗病毒的感染復(fù)制等自身生物學(xué)特性無(wú)影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種去除B8R和A4化的重組痘苗病毒，解決了現(xiàn)有W活痘苗 病毒為載體的疫苗和生物技術(shù)藥物均未對(duì)載體的免疫優(yōu)勢(shì)進(jìn)行削弱，極大地制約了疫苗的 有效性的問(wèn)題，且提高了痘苗病毒的安全性。
[000引本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種去除B8R和A4化的重組痘苗病毒的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供一種去除B8R和A4化的重組痘苗病毒的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，去除B8R和A4化的重組痘苗病毒，對(duì)痘苗病毒進(jìn)行重 組改造，去除B8R和A4化，其中B8R和A4化的堿基序列分別見(jiàn)序列表1和2。
[0011] 本發(fā)明所采用的第二個(gè)技術(shù)方案是:去除B8R和A4化的重組痘苗病毒的制備方法， 具體包括如下步驟：
[0012] 步驟1，構(gòu)建質(zhì)粒地8R-0VA和pA47kEGFP;
[0013] 步驟2,將質(zhì)粒地8R-0VA在CV-I細(xì)胞中與野生型痘苗病毒重組，獲得中間產(chǎn)物重組 病毒VACV- A B8R-0VA;然后質(zhì)粒pA47kEGFP在CV-I細(xì)胞中與VACV- A B8R-0VA病毒重組，獲 得終產(chǎn)物重組痘苗病毒VACV- A B8R A A4化-EGFP;
[0014] 步驟3，篩選純化重組痘苗病毒VACV- A B8R A A4化-EGFP。
[0015] 本發(fā)明所采用的第S個(gè)技術(shù)方案是，去除B8R和A4化的重組痘苗病毒作為疫苗和 生物技術(shù)藥物載體的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明同時(shí)去除B8R和A4化對(duì)外源抗原免疫原性的影響，痘 苗病毒自身的免疫優(yōu)勢(shì)顯著降低，在痘苗病毒載體中插入的外源性抗原能夠成功地誘導(dǎo)有 效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并能夠產(chǎn)生免疫記憶，再次感染誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)。本發(fā)明 構(gòu)建的重組痘苗病毒，可顯著提高W痘苗病毒為載體的疫苗的有效性，為疫苗研發(fā)和基因 治療提供更為有效的方法和載體。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是終產(chǎn)物VACV-A B8R A A4化-EGFP病毒篩選時(shí)顯示的綠色巧光蛋白陽(yáng)性的空 斑；
[0018] 圖2是重組病毒中B8R和A4化基因；分子量標(biāo)記Marker III，泳道1和2分別為野生 型痘苗病毒產(chǎn)生的B8R( 11 Ubp)和A4化（1109bp)條帶，泳道3和4顯示VACV- A B8R A A4化-EGFP無(wú)特異條帶產(chǎn)生；
[0019] 圖3是重組病毒中OVA基因擴(kuò)增，分子量標(biāo)記Marker III，泳道1和2分別為中間產(chǎn) 物VACV- A B8R-0VA和終產(chǎn)物VACV- A B8R A A4化-EGFP產(chǎn)生的OVA條帶（145化P)，泳道3顯示 野生型痘苗病毒無(wú)特異條帶產(chǎn)生；
[0020] 圖4是OVA蛋白的表達(dá)，泳道1、2、3分別為終產(chǎn)物VACV- A B8R A A4化-EGFP、中間產(chǎn) 物VACV- A B8R-0VA和野生型痘苗病毒感染后細(xì)胞中OVA蛋白的表達(dá)；
[0021] 圖5是重組病毒在BSC-I細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線；
[0022] 圖6是重組病毒在CV-I細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線；
[0023] 圖7是重組病毒誘導(dǎo)的初次細(xì)胞免疫應(yīng)答；
[0024] 圖8是重組病毒誘導(dǎo)的免疫記憶；
[0025] 圖9是小鼠感染重組病毒后的體征及神經(jīng)行為評(píng)分變化曲線；
[00%]圖10是小鼠感染重組病毒后的體重變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] 本發(fā)明中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029] 所使用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0030] 野生型痘苗病毒W(wǎng)R株在西安醫(yī)學(xué)院分子病毒與病毒免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室（W下稱本實(shí)驗(yàn) 室)保藏，內(nèi)嵌OVA基因的重組痘苗病毒(VACV-OVA)由申請(qǐng)人構(gòu)建并在本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒 祀GFP-Nl購(gòu)自Clontech公司，質(zhì)粒pSCl 1由美國(guó)NIH的Bernard Moss教授惠贈(zèng)，細(xì)胞系CV-I 和BSC-I購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、。所使用的小鼠為雌性6周齡巧7BL/6小鼠，體重18-22g，購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物繁育中屯、，飼養(yǎng)于恒溫恒濕的SPF級(jí)鼠房。
[0031] 主要試劑和材料：
[0032] DMEM，胎牛血清，脂質(zhì)體Qipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Invitrogen公司， Taq酶、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購(gòu)自肥B公司，病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自Biomiga 公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。所有引物合成及測(cè)序均委托上海 英濰捷基公司進(jìn)行。
[0033] 本發(fā)明去除B8R和A4化的重組痘苗病毒的制備方法和鑒定過(guò)程，具體包括如下步 驟：
[0034] 步驟1、質(zhì)粒pSCll-OVA的構(gòu)建和鑒定
[0035] 1. IOVA基因片段的獲得
[0036] 從病毒VACV-OVA中獲得所需的OVA編碼基因，并在其兩端添加構(gòu)建重組質(zhì)粒所需 的酶切位點(diǎn)。具體操作如下：
[0037] 1.1.1取-80°C凍存的VACV-OVA病毒20化1，解凍后加入等體積的化Y buffe混勻， 室溫放置15分鐘。加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇，轉(zhuǎn)移裂解液至吸附柱中，離屯、后將過(guò)濾柱轉(zhuǎn) 移至一個(gè)新的收集管中，650山Wash buffer清洗過(guò)濾柱2次，離屯、棄廢液。將過(guò)濾柱放入新 的收集管中，加入30-5化1 DEPC水洗脫DNA，將病毒基因組DNA放置于-20°C備用。
[003引 1.1.2利用OVA引物OVA-Fl和OVA-Rl從VACV-OVA基因組DNA中獲得帶有相應(yīng)酶切位 點(diǎn)的OVA基因片段。
[0039] OVA-Fl ： 5'-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG(下劃線之前部分為保護(hù)堿基，下劃 線部分為化Ol酶切位點(diǎn)識(shí)別序列，其后為序列3的第1-19位）；
[0040] OVA-Rl: 5'-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3'（下劃線之前部分為保護(hù)堿基， 下劃線部分為XmaI酶切位點(diǎn)識(shí)別序列，其后為序列3的第1161-1180位的反向互補(bǔ)序列）。 [0041 ] PCR擴(kuò)增體系為：DNA 化l，dNTP mix(2.5mM)化1，引物OVA-Fl(IOyM)Iyl ,OVA-Rl (IOiiM)化Iaoxhq buffer 5iil，Taq酶化1，加DEPC水至總體積50iU。
[0042] PCR擴(kuò)增條件為:95 °C預(yù)變性5分鐘;95 °C變性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸70秒， 循環(huán)30次;72°C延伸5分鐘，最后置于4°C ;
[0043] PCR擴(kuò)增結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，OVA基因片段為1200bp。
[0044] 1. ^SCl I-OVA的構(gòu)建和鑒定
[0045] 用限制性內(nèi)切酶Nco I和XmaI對(duì)OVA基因片段進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒 pSCl 1的大片段進(jìn)行連接，將OVA基因連接到pSCl 1質(zhì)粒的啟動(dòng)子P7.5之后，獲得重組質(zhì)粒， 酶切和測(cè)序鑒定無(wú)誤后，得到質(zhì)粒pSCll-OVA。具體步驟如下：
[0046] A.酶切體系：Iiig相應(yīng)質(zhì)?；蚧蚱?，2化IOx T buffer，化L BSA，抓相應(yīng)的限 制性內(nèi)切酶，dd出0定容至20化，酶切條件37°C，3小時(shí)；
[0047