一種通過分步補(bǔ)料提高l-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]L-繳氨酸屬于分支鏈氨基酸(branched chain amino acid,BCAA )，是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛用于醫(yī)藥、食品及調(diào)味劑、動物飼料和化妝品的制造。在醫(yī)藥上，L-纈氨酸對肌肉蛋白合成和分解具有極大的耐受性，是制造復(fù)合氨基酸輸液和氨基酸注射液的原料，近年來已作為氨基酸原料藥中用量最大的品種之一，L-纈氨酸是合成一種免疫抗生素的重要中間體，由其合成的纈氨霉素是一種環(huán)肽類化合物，被認(rèn)為是生物體內(nèi)鉀離子穿過生物膜的載體之一，其與鉀離子配位可形成C3的對稱構(gòu)象，在生物體的生命活動中扮演著重要角色。在食品上，由其合成的氨基酸埃絲肽可用作美容食品，能有效改善現(xiàn)代女性睡眠不足、解除疲勞、增強(qiáng)食欲，增強(qiáng)皮膚彈性、張力、光澤、柔性，改善皮膚粗糙，增強(qiáng)精力、活力，改善腰疼、肌肉痛、緩和應(yīng)激等效果。在飼料上，對動物乳腺組織分泌乳汁有重要作用。目前國內(nèi)外L-纈氨酸生產(chǎn)廠家日漸增多，但是發(fā)酵周期長，產(chǎn)酸偏低，副酸多影響提取質(zhì)量的問題一直是困擾L-纈氨酸規(guī)?；a(chǎn)的主要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝，通過對培養(yǎng)基配方的調(diào)整，并同時采取分時段補(bǔ)料工藝及分段控制溶氧的方式，促進(jìn)了纈氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)作用，減少了副酸的生成。
[0004]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，所提供的技術(shù)方案是:一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝，包括以下步驟:
(I )、培養(yǎng)成熟的菌種:先進(jìn)行空罐滅菌和實(shí)罐滅菌，滅菌結(jié)束后降溫冷卻，然后進(jìn)行接種，在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)后得到成熟的菌種:培養(yǎng)溫度34-36°(:，？!16.8-7.2，溶氧>25%，壓力 0.03-0.08MPa，風(fēng)量 0.3VVM-2.0VVM ；
(2)、發(fā)酵罐培養(yǎng):先進(jìn)行空罐滅菌和實(shí)罐滅菌，滅菌結(jié)束后降溫冷卻，然后將步驟(I)得到的成熟菌種接種至發(fā)酵罐內(nèi)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)以制取L-色氨酸:培養(yǎng)溫度34-360C，pH采用補(bǔ)充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h_放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0_18hl0_25%，18h-放罐 15-40%，壓力0.03-0.08MPa，風(fēng)量 0.3VVM-2.0VVM，過程中殘?zhí)强刂?.01-
0.5%，在發(fā)酵進(jìn)行的10-15h，18-24h，28_32h，分別補(bǔ)入培養(yǎng)基玉米漿用量的20%、20%、10%的滅菌玉米漿繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。
[0005]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-繳氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述步驟(I)中使用的培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖I.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.4%、KC1 0.05-0.3%、MgS04 0.08-0.45%、(NH4)2SO40.06-0.24%、檸檬酸0.08-0.42%、FeSO4 0.00014-0.00042%、MnS04 0.00006-0.00036%、維生素BI 0.000065-0.00039%、生物素0.00001-0.00012%，其余為水。
[0006]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-繳氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述步驟(2)中使用的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖1%、酵母粉
0.1%^(NH4)2HPO4 0.12-0.8%^KCL 0.12-0.8%^MgSO4 0.05-0.5%^(NH4)2SO4 0.08-0.48%、檸樣酸0.05-0.5%、FeSO4 0.001-0.l%、Na2S〇4 0.0005-0.006%、MnS04 0.00015-0.0009%、CuSO4 0.00002-0.00018%、CoCl2 0.00014-0.00135%、ZnS04 0.0001-0.0018%，其余為水。
[0007]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述空罐滅菌的具體操作為:罐體清洗干凈，認(rèn)真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進(jìn)行空罐滅菌，滅菌壓力為0.11-0.1210^，溫度121-123°(:，時間為45-6011^11。
[0008]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-繳氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述實(shí)罐滅菌的具體操作為:將原料充分溶解后用栗栗入種子培養(yǎng)罐中，開列管升溫至80°C后，開蒸汽進(jìn)入罐內(nèi)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.11-0.1210^，溫度121-123°(:，時間為10-30mino
[0009]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-繳氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述步驟(I)中接種的具體操作為:采用壓差法進(jìn)行接種，調(diào)PH至6.9，溫度35°C，壓力0.06MPa，在火焰下旋開接種口防護(hù)蓋，并迅速將種瓶接種管連接與接種口，緩慢調(diào)節(jié)壓力至0.03MPa，接種結(jié)束后，在火焰下拔下接種罐，并迅速將接種口防護(hù)蓋選在接種口上。
[0010]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述步驟(2)中接種的具體操作為:調(diào)pH至6.9，溫度35°C，壓力0.06MPa，將種子罐內(nèi)培養(yǎng)成熟的種子液壓入發(fā)酵罐內(nèi)。
[0011]作為本發(fā)明一種通過分步補(bǔ)料提高L-纈氨酸產(chǎn)酸的發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化:所述步驟(I)中接種用菌液的制備方法為:取已經(jīng)菌種生長飽滿的茄型瓶，用生理鹽水50ml在火焰保護(hù)下注入，并用接種環(huán)或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉(zhuǎn)移到接種瓶內(nèi)。
[0012]有益效果
申請人針對目前發(fā)酵工藝方法中的不足，在天津科技大學(xué)、中國氨基酸技術(shù)服務(wù)中心的幫助指導(dǎo)下，通過對培養(yǎng)基配方的調(diào)整，并同時采取分時段補(bǔ)料工藝及分段控制溶氧的方式，促進(jìn)了纈氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途徑中的反饋調(diào)節(jié)作用，減少了副酸的生成。這種分時段的補(bǔ)料方式，不僅滿足了菌體在生長過程中對營養(yǎng)的需要，同時解除了高濃度營養(yǎng)成分對菌體生長的抑制作用，提高了原料的利用率，尤其對糖酸轉(zhuǎn)化率的提尚有極大的作用，而溶氧分段控制，對質(zhì)粒穩(wěn)定性的提尚及目的基因的尚效表達(dá)也有積極的作用。本發(fā)明的發(fā)酵工藝能使L-纈氨酸產(chǎn)酸由原來的70-80h產(chǎn)酸4.5-5.5%提高到現(xiàn)在的50-55h產(chǎn)酸7.0-8.0%，轉(zhuǎn)化率由原來的20-25%提高到30-32%，并且副酸較少有利于后續(xù)提純。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明:
實(shí)施例1 (I)、培養(yǎng)成熟的菌種菌液的制備:
取已經(jīng)菌種生長飽滿的茄型瓶，將生理鹽水50ml在火焰保護(hù)下注入，并用接種環(huán)或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉(zhuǎn)移到接種瓶內(nèi)。
[0014]成熟的種子的培養(yǎng):
a、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認(rèn)真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進(jìn)行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實(shí)罐滅菌:將按規(guī)定含有一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養(yǎng)罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進(jìn)入罐內(nèi)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結(jié)束后，打開列管內(nèi)冷卻水進(jìn)行降溫，降溫至36°C，關(guān)閉列管冷卻水；
d、接種:采用壓差法進(jìn)行接種，調(diào)pH6.9，溫度32°C，壓力0.06MPa，在火焰下旋開接種口防護(hù)蓋，并迅速將種瓶接種管連接與接種口，緩慢調(diào)節(jié)壓力至0.03 MPa，此時種液在壓差下進(jìn)入罐內(nèi)，接種結(jié)束后，在火焰下拔下接種罐，并迅速將接種口防護(hù)蓋選在接種口上，火焰灼燒約Imin;
e、培養(yǎng):培養(yǎng)溫度30-32°C，pH通過補(bǔ)充液氨自動控制6.8-7.2，溶氧>25%，壓力0.03-0.08MPa，風(fēng)量 0.3WM-2.0VVM ；
使用的培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖3.0%，玉米楽3.5%，酵母粉0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，豆?jié)?.5%，硫酸鎂0.04%，維生素BI 0.00003%，生物素0.00002%，其余為水。
[0015](2)、發(fā)酵罐培養(yǎng)
b、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認(rèn)真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進(jìn)行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實(shí)罐滅菌:將按規(guī)定含有一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養(yǎng)罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進(jìn)入罐內(nèi)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結(jié)束后，打開列管內(nèi)冷卻水進(jìn)行降溫，降溫至32°C，關(guān)閉列管冷卻水；
d、接種:將種子罐內(nèi)培養(yǎng)成熟的種子液壓入發(fā)酵罐內(nèi)；
e、培養(yǎng):培養(yǎng)溫度30-32°C，pH采用補(bǔ)充液氨自動控制7.0-7.2，溶氧分段控制，0-18h20-30%，18h-放罐 10-20%，壓力0.03-0.08MPa，風(fēng)量0.3VVM-2.0VVM，過程中殘?zhí)强刂?br>0.01-0.5%。在發(fā)酵進(jìn)行的1h，18h，28h，分別補(bǔ)入底料玉米漿用量的20%、20%、10%的滅菌玉米楽繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。
[0016]使用的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖8.0%，玉米漿5.0%，豆?jié)?.0%，磷酸二氫鉀0.18%，硫酸鎂0.08%，硫酸錢0.3%，L_蛋氨酸0.05%,L-異亮氨酸0.006%，L-亮氨酸0.02%，維生素BI 0.00002%，生物素0.00001%，其余為水。
[0017]通過該種方式培養(yǎng)，發(fā)酵周期:55h，產(chǎn)酸7.2%，轉(zhuǎn)化率31.3%。
[0018]實(shí)施例2
(I)、培養(yǎng)成熟的菌種菌液的制備:
取已經(jīng)菌種生長飽滿的茄型瓶，將生理鹽水50ml在火焰保護(hù)下注入，并用接種環(huán)或者玻璃刮刀將表面菌種刮落入生理鹽水中，然后將含有菌種的生理鹽水在無菌操作下轉(zhuǎn)移到接種瓶內(nèi)。
[0019]成熟的種子的培養(yǎng):
c、空罐滅菌:罐體清洗干凈，認(rèn)真檢查閥門及人孔后，開蒸汽進(jìn)行空罐滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為45min;
b、實(shí)罐滅菌:將按規(guī)定含有一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度的原料充分溶解后用栗栗入種子培養(yǎng)罐中，開列管升溫至80 0C后，開蒸汽進(jìn)入罐內(nèi)對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌壓力為0.12MPa，溫度121°C，時間為 15min;
c、降溫冷卻:滅菌結(jié)束后，打開列管內(nèi)冷卻水進(jìn)行降溫，降溫至36