一種酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及稀有人參皂苷Rhl的制備方法，尤其涉及利用重組表達的來源于α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶轉化人參皂苷Re生成Rhl。
【背景技術】
[0002]人參(Panaxginseng)是亞洲傳統(tǒng)的名貴中藥材，人參皂苷是其主要的生物活性物質，具有生物活性顯著、藥理作用獨特等特點。隨著分析技術水平的提高，人參皂苷的化學成分得到了進一步的明確，現(xiàn)已經分離鑒定出180余種人參皂苷單體，其中5種主要皂苷(人參皂苷Rb 1、Rb2、Re、Re和Rg I)占總皂苷的80 %以上，而人參皂苷(Rg3、Rh2、Compound K、Rg2、Fl和Rhl)含量很低，稱為稀有阜苷(Applied Microb1logy and B1technology,2012，94:673-682)，但其藥理活性優(yōu)于上述高含量的人參皂苷。
[0003]稀有皂苷Rhl具有啟動和增強免疫應答，促進肝細胞增殖、殺傷腫瘤細胞，以及抗老化等生理作用，可用于調節(jié)機體免疫功能，治療和預防肝炎等。但稀有皂苷Rhl在植物中含量很低，直接提取工藝復雜，成本太高。而人參皂苷Re在人參總皂苷中含量較高，與稀有人參皂苷Rhl具有相似的化學結構，因此，可以通過對人參皂苷Re進行轉化得到Rhl (圖1)，但需要特異性的降解C20位上的鼠李糖基和C6位上的葡萄糖基。
[0004]利用化學法和生物轉化法可以將人參皂苷Re轉化為Rhl。但化學轉化法因其反應劇烈、選擇性差、副產物多等缺點而不被采用。生物轉化具有反應條件溫和，特異性好等特點而受到青睞。目前人參皂苷的生物轉化法主要有微生物轉化法和酶轉化法。微生物轉化法因其轉化體系復雜，容易產生副產物，對產品的純度有一定影響。如，董阿玲等發(fā)現(xiàn)黑曲霉和藍色犁頭霉能轉化人參皂苷Rgl生產人參皂苷Rhl，但存在轉化周期較長，且有其它皂苷副產物等缺點(中國藥物，2001，10(3): 115-118)。酶法轉化能避免微生物轉化法的缺陷，但各種酶對底物的專一性不同，降解的糖苷鍵類型也各不相同，因此，尋找能高效、特異性降解人參皂苷Re生產人參皂苷Rhl的糖苷水解酶成為了研究關鍵。目前，還沒有利用酶轉化人參皂苷Re生產人參皂苷Rhl的報道。

【發(fā)明內容】

[0005]解決的技術問題:本發(fā)明提供了一種酶法制備稀有人參皂苷Rhl的方法，該方法所使用的重組酶分別來源于Thermotoga petrophila的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(AspergiIIusniger)的α-鼠李糖苷酶。
[000?] 技術方案:一種酶法制備稀有人參阜苷Rh I的方法，利用來源于Thermo togapetrophila的β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(AspergilIus niger)的α-鼠李糖苷酶，降解人參阜苷Re生產Rhl。
[0007]所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0009]所述β-葡萄糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0010](I)以提取的Thermotoga petrophila基因組DNA為模板，用具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0011](2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
[0012](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21(DE3)，IPTG誘導β-葡萄糖苷酶表達，收集菌體，破碎細胞，80 0C熱處理40分鐘，獲得純化的β_葡萄糖苷酶。
[0013]所述α-鼠李糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0014](I)以提取的黑曲霉(Aspergillus niger)NL_lcDNA為模板，用具有SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到α-鼠李糖苷酶的DNA分子；
[0015](2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET_20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有α_鼠李糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
[0016](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21(DE3)，誘導α-鼠李糖苷酶表達，收集菌體，破碎細胞，離心獲α_鼠李糖苷酶。
[0017]所述酶法制備稀有人參皂苷Rhl的方法中的降解條件為:
[0018](l)lg/L人參皂苷Re，i3_葡萄糖苷酶0.2U，pH 5.0，85°C條件下，降解Ih;
[0019](2)將上述反應液加入α-鼠李糖苷酶6.6U，調整pH為6.5，35°C條件下，降解Ih，最終可以將人參皂苷Re轉化為人參皂苷Rhl，摩爾得率為95%。
[0020]有益效果:1.通過酶法催化人參皂苷Re生產稀有人參皂苷Rhl，生成的稀有人參皂苷Rhl純度高，沒有副產物。2.酶法轉化的效率高，摩爾得率達到95%。
【附圖說明】
[0021]圖1是人參皂苷Re和Rhl的結構示意圖；
[0022]圖2是本發(fā)明實施例提供的溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響圖；
[0023]圖3是本發(fā)明實施例提供的pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響圖；
[0024]圖4是本發(fā)明實施例提供的Re轉化生成Rg2的時間曲線圖；
[0025]圖5是本發(fā)明實施例提供的溫度對α-鼠李糖苷酶活性的影響圖；
[0026]圖6是本發(fā)明實施例提供的pH對α-鼠李糖苷酶活性的影響圖；
[0027]圖7是本發(fā)明實施例提供的Rg2轉化生成Rhl的時間曲線圖。
【具體實施方式】
[0028]下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅為本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0029]為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細闡述，其中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到;如無特殊說明，實施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實驗指南第三版》。
[0030]實施例1:重組質粒pET-20b_bgl的構建[0031 ] 1.1 Thermotoga petrophila的培養(yǎng)
[0032]Thermotoga 口61^0口11；[1&購于03]\12菌種保藏中心(www.dsmz.de)編號為D SM13995 ο其培養(yǎng)基配方為:10g/L可溶性淀粉，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L肉浸液，10g/L2-嗎啉乙磺酸，10mg/L七水合硫酸鐵，lmg/L刃天青，調pH為7.2，煮沸充氮氣，除去氧氣后，培養(yǎng)基在無氧條件下裝入?yún)捬跗繙缇?。用注射器按?.5wt接種量接種，85°C靜止培養(yǎng)24h，收集細胞。
[0033]1.2基因組DNA的提取
[0034](I)靜置培養(yǎng)Thermotoga petrophila 24h，取30mL菌液4，000g離心1min收集細胞。
[0035](2)用9.5mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.5mL 1wt.%十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37°C保溫Ih。
[0036](3)加入 1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)/NaCl，混勻，65°C 溫育 20min。
[0037](4)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，混勾，6，000g離心lOmin。
[0038](5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉入另一離心管中，加入等體積酸/氯仿/異戊醇混勾(體積比25:24:1)，6，OOOg離心1min。
[0039](6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀DNA沉淀清晰可見。
[0040](7)用吸管將DNA纏繞其上，在70vt.%酒精中清洗。
[0041 ] (8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉入1.5mL離心管中。
[0042](9)室溫下風干，加500yL TE緩沖液溶解。
[0043 ] (10)取50yL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0044]1.3重組質粒pET-20b_bgl的構建
[0045]按照已知的Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因(YP_001244492.1)設計引物:(SEQ ID NO:5)下劃線表示Nde I酶切位點；(SEQ ID NO:6)下劃線表示Xho I酶切位點，并去除終止密碼子；以提取的Thermotoga petrophila的基因組DNA為模板，用合成的引物進行PCR擴增，擴增的條件是94°C，3min ； 30次循環(huán)(94°C，30s ; 58°C，30s ; 72°C，2min I Os); 72 °C，I Omin;反應停止，4 °C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化。得到T.petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因。
[0046]得到Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因和pET_20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細胞，轉化產物涂布到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)固體培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)，接種幾個單菌落到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10小時后，收集菌體提取質粒，酶切驗證去除空載質粒，將重組質粒進行核酸序列測定，得到正確的重組表達載體pET20b-bgl。
[0047]2.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的表達及純化
[0048]將重組質粒pET-20b-bgl轉化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100yg/mL)的LB平板(LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L)上經過37 °C培養(yǎng)過夜，挑轉化子到200mL的LB培養(yǎng)基中(100yg/mL Amp)37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6OO為0.6時，加入終濃度為0.5mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導劑，30 °C誘導培養(yǎng)8h，用高速冷凍離心機將培養(yǎng)液在4 °C下，以13，OOOrpm離心15min，收集菌體，去上清加入無菌水，超聲波破碎細胞，隨后70°C熱處理30min，用高速冷凍離心機將培養(yǎng)液在4°C下，以13，OOOrpm離心15min，上清即為重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的純酶。
[0049]3.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶轉化Re為Rg2的條件
[0050]3.1酶活測定
[0051 ]反應體系200yL，10yL 20mmol/LPNPG中加入10yL 100mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)和適量的水，先在90 0C孵育2min，再加入5yL酶液(稀釋到合適的倍數(shù))反應lOmin。反應結束后立刻加入600yL IM的Na2CO3,用分光光度計在405n