用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分離的其多核苷酸 ...的制作方法
【專利說明】用于從水解方式裂解玉米赤霉稀酬和/或玉米赤霉稀酬衍生 物的多化，分離的其多核昔酸，從及包含多化的添加劑、其用 途及方法
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于W水解方式裂解玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生 物的多膚，編碼此類多膚的分離的多核巧酸，W及包含此類多膚的添加劑，還設(shè)及此類多膚 的用途，W及設(shè)及用于W水解方式裂解玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生物 的方法。
[0002] 真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝物。其一個(gè)重要的代表是世界范圍傳播的玉 米赤霉締酬(ZENK W前稱為F-2毒素），其由許多鑲抱菌真菌產(chǎn)生。運(yùn)些真菌尤其侵染栽培 植物，例如各種各樣的谷類，其中真菌侵染通常出現(xiàn)在收獲之前，其中真菌生長(zhǎng)或真菌毒素 產(chǎn)生可W在收獲之前發(fā)生，或者在不適當(dāng)?shù)哪懖氐那闆r下也可W在收獲之后發(fā)生。FAO估 計(jì)，在世界范圍內(nèi)25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，運(yùn)導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在一項(xiàng)最近在世 界范圍內(nèi)進(jìn)行的研究中，從2009年1月至2011年12月分析了總共23,781個(gè)樣品，其中81%經(jīng) 測(cè)試為對(duì)于至少一種真菌毒素來說陽性和45%對(duì)于ZEN來說陽性。可W在世界的所有地區(qū) 中，同樣地在所有經(jīng)測(cè)試的谷物類別和飼料類別，例如玉米、大豆粉、小麥、麥教、孤GS(干酒 糟）中，W及在預(yù)制飼料混合物中，W直至100%的頻率發(fā)現(xiàn)ZEN。
[0003] ZEN是一種非醬類的、雌激素的、大環(huán)的、通過聚酬化合物物質(zhì)代謝途徑合成的內(nèi) 醋，其具有下述結(jié)構(gòu)式：
[0004]
[0005] 和IUPAC命名名稱"(沈，11S)-15,17-二徑基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八 碳-1(18),2,14,16-四締-7,13-二酬"。
[0006] 然而，在自然界中還存在有許多ZEN衍生物，其通過ZEN的酶促或化學(xué)修飾而形成。 關(guān)于此的例子為糖巧式的或含硫酸醋的ZEN綴合物，其由真菌、植物或哺乳動(dòng)物代謝來形 成；W及ZEN代謝物，其尤其在人或動(dòng)物機(jī)體中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中 存在的或者通過化學(xué)或生物化學(xué)合成而制備的ZEN綴合物或ZEN代謝物，但特別地是指a-玉 米赤霉締醇(a-Z化；（26,73，115)-7，15，17-^徑基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八 碳-l(18)，2，14，16-四締-13-酬）、(6-玉米赤霉締醇((6-Z化；（沈，7S，llS)-7，15，17-S?基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-la8)，2，14，16-四締-13-酬）、a-玉米赤霉醇(a-ZAレ（7R，llS)-7，15，17-S?基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-l(18)，14，16-S 締-13-酬）、e-玉米赤霉醇（0-241;(75，115)-7，15，17-^徑基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán) [12.4.0]十八碳-1(14)，15，17-^締-13-酬）、玉米赤霉締酬-14-硫酸醋(2145;[(沈，115)-15-徑基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四締-17-基]硫酸氨醋）、玉米赤霉締酬-14-糖巧(Z14G;(2E，11S)-15-^基-11-甲基-17-[(3R，4S， 55,610-3,4,5-^徑基-6-(徑甲基）四氨化喃-2-基]氧基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1 a8)，2，14，16-四締-7，13-二酬似及玉米赤霉酬(ZAN;(llS)-15，17-二?基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18)，14,16-S締-7,13-二酬）。
[0007] ZEN，同樣地還有ZEN衍生物，尤其是a-ZEL、(6-ZEL、Z14S、a-ZAL、(6-ZAL、Z14G和ZAN， 由于其高的化學(xué)和物理穩(wěn)定性而還可W在經(jīng)加工的食品或飼料例如面包或啤酒中檢測(cè)到。 [000引ZEN與雌激素受體結(jié)合并且可W引起激素素亂，其中它在經(jīng)口攝取后立即被吸收， 并且被哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)立體異構(gòu)的代謝物，分別為a-ZHj日P-ZEL。在此，例如a-ZEL，還 有a-ZAL或ZAN具有比ZEN強(qiáng)得多的動(dòng)情效應(yīng)。經(jīng)綴合的ZEN衍生物有時(shí)具有比ZEN低的雌激 素活性，然而如果情況可能，ZEN可W從運(yùn)些ZEN衍生物中重新被釋放到消化道中。
[0009] 雖然ZEN具有相對(duì)低的急性毒性并且具有直至20 ,OOOmgAg體重的口服LD50值，但 是在較長(zhǎng)期攝入的情況下在動(dòng)物或人中出現(xiàn)亞急性和/或亞慢性的毒性效應(yīng)，例如致崎形 的、致癌的、動(dòng)情的和免疫抑制的效應(yīng)。被ZEN污染的飼料導(dǎo)致哺乳動(dòng)物中的發(fā)育障礙，其中 豬，特別是幼豬對(duì)于ZEN是極其敏感的。超過0.5ppm的在飼料中的ZE腳農(nóng)度導(dǎo)致發(fā)育障礙，其 中例如超過1.5ppm的濃度可W導(dǎo)致豬中的超雌激素活性，和12ppm ZEN的濃度被認(rèn)為對(duì)牛 中的流產(chǎn)負(fù)責(zé)。由于玉米赤霉締酬通過粘膜，特別是通過胃粘膜，但也通過口腔粘膜被迅速 吸收，因此立即的和尤其是定量的純化是必要的。在ZEN的口服給藥后30分鐘已經(jīng)可W在血 液中檢測(cè)到它們。在運(yùn)種情況下，使用經(jīng)分離的針對(duì)微生物的酶具有優(yōu)點(diǎn)，例如更高的比活 性或更快的作用。由于ZEN的有害效應(yīng)，因而在歐盟存在有在食品中的強(qiáng)制性的ZEN上限W 及對(duì)于在飼料中的ZEN上限的推薦化C NO: 1881/2006)。
[0010] 為了減少食品或飼料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生長(zhǎng)，例如通過遵循"良好 的農(nóng)業(yè)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)"。運(yùn)尤其包括，種子沒有害蟲和真菌侵染，或者及時(shí)從田地中移除農(nóng)業(yè)廢 料。此外，還可W通過使用殺真菌劑來減少田地上的真菌生長(zhǎng)。在收獲之后，應(yīng)當(dāng)將收獲物 儲(chǔ)藏在低于15%的殘留水分含量和低的溫度下，W阻止真菌生長(zhǎng)。同樣地，應(yīng)當(dāng)在再加工之 前去除由于真菌侵染而被污染的物料。盡管有著運(yùn)一系列措施，但I(xiàn).Ro化iges和K.化e虹er (2012)仍然報(bào)道了，即使在具有最高農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的地區(qū)，例如USA和中歐，在2009年至2011年 中，分別有29 %和39 %的經(jīng)測(cè)試的玉米樣品被ZEN污染。
[0011] 用于從飼料或食品中去除ZEN的其他可能性為真菌毒素的吸附或轉(zhuǎn)化。為此所必 需的是，真菌毒素與吸附劑的結(jié)合在寬的pH范圍內(nèi)是強(qiáng)的且特異的，并且在胃腸區(qū)域內(nèi)的 整個(gè)消化過程中保持穩(wěn)定。雖然對(duì)于黃曲霉毒素可W有效地使用幾種非生物吸附劑，例如 活性炭、娃酸鹽或合成的聚合物，例如消膽胺，但是它們用于其他真菌毒素則受到限制。吸 附劑的主要缺點(diǎn)是其他有時(shí)候?qū)τ跔I(yíng)養(yǎng)供給來說必需的分子的非特異性結(jié)合。在文獻(xiàn)中同 樣也描述了生物吸附劑，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附劑像非生物吸附劑一樣也 具有類似的限制。
[0012] 通過物理和化學(xué)處理來對(duì)ZEN進(jìn)行解毒也受到限制。通過熱處理，不能有效地使 ZEN純化，但是可W通過擠出和用氧化劑進(jìn)行處理，例如在80°C下用10%的過氧化氨溶液處 理16小時(shí)，來使ZEN含量降低83.9%。在飼料和食品的制備中擠出方法和氧化劑例如臭氧或 過氧化氨的使用，由于高的成本、品質(zhì)損失、有時(shí)候低的效率和低的特異性而受限。
[0013] 借助于微生物例如隧真菌毒素絲抱酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)、粉 紅粘靑霉(Gliocladium roseum)或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)菌株或者從其中分 離出的酶例如水解酶或過氧化物酶來進(jìn)行ZEN的生物轉(zhuǎn)化也例如在E . Vekiru等人， Appl.and Environ.Microb.，2010,76,7,2353-2359中進(jìn)行了描述。
[0014] 從EP 0 938 575B1中知曉了紅球菌屬(I?hodococcus)和諾卡氏菌屬(Nocardia)的 細(xì)菌，特別是球狀紅球菌(R. globerulus)、紅串紅球菌(R. eirthropolis)和球形諾卡氏菌 (N. globerula)的 ZEN 降解特性。
[0015] 從WO 02/076205中可獲知從粉紅粘靑霉中分離出的酶的ZEN降解作用，所述酶尤 其為a/e-水解酶、玉米赤霉締酬水解酶UZ皿1)，其借助于催化S元體來催化ZEN的降解。
[0016] 從WO 2012/113827中獲知重組Zonase,即ZEN降解酶，其在胃腸道中保持穩(wěn)定，特 別地在其中描述了微生物例如褐色雙歧嗜熱菌（Thermobifidia fusca)、脫葉鏈霉菌 (Sheptomyces exfoliatus)、德氏食酸菌（Acidovorans delafieldii)和鏈霉菌屬物種 (Streptomyces sp.)。
[0017] 能夠水解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多膚或酶也可W稱為Zonase。
[0018] 下面所使用的術(shù)語取自專業(yè)用語并且總是W傳統(tǒng)的意義進(jìn)行使用，除非另外指 出。因此，術(shù)語"多核巧酸"設(shè)及具有所有長(zhǎng)度和序列的每一種類型的遺傳物質(zhì)，例如單鏈和 雙鏈DNA和RNA分子，包括調(diào)控元件、結(jié)構(gòu)元件、基因群、質(zhì)粒、全基因組及其片段。名稱"多 膚"包括蛋白質(zhì)，例如酶、抗體，W及具有直至500個(gè)氨基酸的多膚，例如膚抑制劑，蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)域，還有具有小的序列長(zhǎng)度例如少于10個(gè)氨基酸的短多膚，例如受體、配體、膚激素、標(biāo) 簽等。名稱"在多核巧酸或多膚中的'位置'"設(shè)及在所述多核巧酸或多膚的序列中單個(gè)特定 的堿基或氨基酸。
[0019] 現(xiàn)在，本發(fā)明旨在提供運(yùn)樣的多膚W供使用，用所述多膚可成功實(shí)現(xiàn)將ZEN和/或 至少一種ZEN衍生物快速地且可靠地轉(zhuǎn)化為經(jīng)水解的ZEN和/或經(jīng)水解的ZEN衍生物。為了解 決該任務(wù)，本發(fā)明的特征主要在于，所述多膚是具有選自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或 其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同 一性為至少40 %。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，名稱"序列同一性"設(shè)及序列同一性百分比。對(duì)于氨基酸序列和核巧 酸序列，序列同一性可W目視測(cè)定，但是優(yōu)選地用計(jì)算機(jī)程序來計(jì)算出來。還在序列區(qū)段內(nèi) 進(jìn)行序列比較，其中參考序列的連續(xù)序列被理解為區(qū)段，并且優(yōu)選地包含該序列的保守區(qū) 域。
[0021 ] 在當(dāng)前的情況下，序列同一性借助于程序NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)來進(jìn)行測(cè)定，特別地對(duì)于多膚，用BLASTP，和對(duì)于多核巧酸，用BLASTN，其提供 在('National Center for Biotechnology Information"的主頁（NCBI; http :// WWW.ncbi .nlm.n;Lh.gov/)上W供使用。因此，可能的是，根據(jù)Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. ,25:3389-3402)的算法，將兩個(gè)或更多個(gè)序列互相進(jìn)行比較。為了本發(fā)明的目 的，使用2013年5月15日的那個(gè)版本的程序。作為程序設(shè)置，考慮基本設(shè)置，但是特別地，對(duì) 于氨基酸序列比較："最大祀序列（max target sequence)" = 100 期望闊值（expected threshold)" = 10;。字長(zhǎng)(word size)" =3;。矩陣（mahix)" =I3LOSOM62;。缺口成本（gap costs)"=。存在化xistence) : 11;延伸化Xtention) : 1";。計(jì)算調(diào)整（computational adjustment)" =。條件式組成得分矩陣調(diào)整（Conditional compositional score mahix adjustment)" ; W及對(duì)于核巧酸序列比較:字長(zhǎng)：11;期望值(^Expect value): 10;缺口成本： 存在=5,延伸=2;過濾器(Filter)=低復(fù)雜度激活的（low complexity activated);匹 配/錯(cuò)配得分(Match/Mismatch Scores) :2,-3;過濾器字符串（Filter String) :L;m。
[0022] 術(shù)語"功能性多膚變體"或"功能性變體"一方面設(shè)及多膚的"等位基因變體"和多 膚的"功能性片段"，另一方面設(shè)及多膚的"修飾"，其中酶促功能基本上未改變。名稱"等位 基因變體"設(shè)及運(yùn)樣的多膚，所述多膚通過在自然界中隨機(jī)發(fā)生的核巧酸序列突變而產(chǎn)生 并且引起氨基酸序列的改變，其中其酶促功能未受影響。"修飾"可W例如是與多膚的C-末 端或N-末端融合物或者經(jīng)突變的多膚，其中突變可W通過至少一個(gè)氨基酸的置換、插入或 缺失來獲得，運(yùn)特別地通過位點(diǎn)特異性誘變或隨機(jī)誘變、重組和/或任何其他蛋白質(zhì)工程方 法來進(jìn)行。術(shù)語"置換"、"插入"和"缺失"W在基因技術(shù)中通常的和專業(yè)人員熟悉的含義來 進(jìn)行使用。術(shù)語"功能性片段"設(shè)及多膚的部分或部分序列或者其功能性變體