逆轉錄病毒載體的制作方法
【專利說明】逆轉錄病毒載體 發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明設及一逆轉錄病毒載體，其中順式作用元件位于3'LTR的下游。運些元件因 此存在于所述病毒的RNA基因組中，運樣可W被包裝進病毒顆粒，但在所述被逆轉錄的基因 組區(qū)域外，因此不在所述祀細胞的所述載體DNA中。運減少了轉移載體順式作用元件在祀細 胞內持久性存在的弊端。
[醒]發(fā)明背景
[0003] 逆轉錄病毒載體是最早開發(fā)的用于哺乳動物基因轉移的病毒載體之一。幾種逆轉 錄病毒已被開發(fā)成為載體，特別地有alpha逆轉錄病毒（1) ,gamma逆轉錄病毒(2)，慢病毒I 型人免疫缺陷病毒化IV-I) (3)，非人類慢病毒(4)，W及泡沫病毒(5)。
[0004] 在從逆轉錄病毒改進為逆轉錄病毒載體中最重要的結構改變?yōu)閷l(fā)生基因轉移 的核酸上的需要W順式起作用的病毒的非編碼序列與產(chǎn)生病毒顆粒的生產(chǎn)細胞中需要W 反式起作用的病毒蛋白編碼序列分離。由于在祀細胞內不產(chǎn)生病毒蛋白，運種分離使得所 述載體只能感染一輪。
[0005] -種標準的第S代基于HIV-I的慢病毒載體，如服L或CCL(3)要求四種質粒共轉進 入生產(chǎn)細胞才能產(chǎn)生病毒顆粒（圖1): 一含有必要的順式作用元件和轉基因表達框的轉移 載體、一表達HIV-I多聚蛋白Gag和Gag-化1的包裝質粒、一表達HI V-IRev蛋白的質粒和一表 達所述病毒包膜蛋白的質粒。如果在生產(chǎn)細胞中共表達其他包膜病毒的包膜蛋白，慢病毒 載體也能夠將該包膜蛋白包括在內，運種現(xiàn)象被稱為假型。最常用的包膜蛋白是水泡性口 炎病毒糖蛋白（VSVG)，其賦予慢病毒載體病毒顆粒穩(wěn)定性和廣泛的親嗜性(6)。
[0006] 在所述轉移載體中包含的所述必要的順式作用元件包括所述HIV-I長末端重復序 列化TRs)，所述RNA包裝信號（W )，W及優(yōu)選地所述Rev應答元件(RRE)。所述LTRs包含轉錄、 逆轉錄和所述載體基因組整合所需要的序列。在自我失活(SIN)的轉移載體中幾乎所有的 病毒3'端U3區(qū)域都被移除W消除其啟動子和增強子的活性(3)。逆轉錄的機制為兩個前病 毒的U3均來源于所述RNA基因組的3'LTR，所W用運種載體感染產(chǎn)生的前病毒缺乏LTR驅動 的轉錄，并且不能在祀細胞中有效地轉錄它們的全基因組。所述RNA包裝信號被認為延伸進 入gag編碼序列的啟始，但在gag的啟始密碼子下游引入了一個點突變W防止運一序列中的 大部分被翻譯。Rev蛋白在生產(chǎn)細胞內與所述RRE相互作用W穩(wěn)定轉錄本、促進RNA從細胞核 轉運，并增強RNA包裝進入病毒顆粒(7;8)。非必要但常用的順式作用元件包括一 HIV-I衍生 的中央多聚嚷嶺區(qū)（cPPT)，其增強了不分裂細胞的轉導(9)及一啄木鳥肝炎病毒轉錄后調 控元件(WPRE)，其通過改進多聚腺巧酸化的效率提升了病毒滴度和轉基因的表達。
[0007] 在一標準的第=代慢病毒載體中運些順式作用元件與所述轉基因表達框一起在 祀細胞中被逆轉錄，導致產(chǎn)生包含各自含有23化P的HIV-IDNA的兩個SIN LTR、一個含有 490bp HIV-IDNA的Gag區(qū)的引物結合位點（PBS)、一個含有858bp HIV-IDNA的RRE及一個含 有69bp HIV-IDNA的多聚嚷嶺(PPT)區(qū)的化f的前病毒，遞送到祀細胞中的HIV-IDNA總共為 1889bp。運些病毒順式作用元件與所述轉基因表達框共價結合并且在轉導后在祀細胞中持 久存在。如果用到一整合性慢病毒載體，它們會被不可逆地整合進祀細胞染色體。
[0008] 轉移載體順式作用元件在祀細胞中持久存在的后果
[0009] HIV-I衍生的順式作用元件在祀細胞中長期持久存在對慢病毒載體的實際應用產(chǎn) 生了一些在實驗上被觀察到并且在理論上可能的問題，實際應用設及研究在細胞培養(yǎng)或動 物模型上研究被轉移的基因的生物學效應、轉基因動物種類和穩(wěn)定細胞系的構建及轉移治 療用基因來治療人的疾病。
[0010] 首先，所述轉移載體的順式作用元件含有具備活性的剪接受體位點，其能夠與宿 主細胞基因發(fā)生剪接形成異常的融合轉錄本（11-13)。一類運種事件在基因治療的臨床試 驗中被觀察到，其中一個拷貝的病人的促進生長的HMGA2基因與整合的慢病毒前病毒之間 發(fā)生剪接，導致了 HMGA2的轉錄調控的異常和轉導的細胞的大量無性擴增(14)。
[0011] 第二，RNA包裝所需的順式作用元件的持久性存在能夠使細胞中表達病毒蛋白的 自我失活的慢病毒載體基因組再活化(15)。如果用在感染HIV的病人體內，運可能會導致慢 病毒載體前病毒再活化及與野生型HIV-I基因組的重組。
[001^ 第；，慢病毒順式作用元件含有不被轉錄的CpG富集的DNA，易發(fā)生DNA甲基化并可 能在宿主細胞中通過沉默對被投送的轉基因表達的減少產(chǎn)生貢獻(16)。
[0013] 第四，大段染色體外DNA載體的非轉錄區(qū)在體內已經(jīng)與轉基因的沉默聯(lián)系在一起 (17)。因此減少染色體外整合缺陷的慢病毒載體(IDLV)內的所述非轉錄區(qū)的大小可能會在 運些載體的應用中改善長期表達。
[0014] 第五，減少所述逆轉錄產(chǎn)物的大小可能會增加慢病毒載體攜帶轉基因的載量。慢 病毒的生命周期中潛在地有多個階段，運限制了載體基因組的大小，例如RNA包裝（18)，在 胞內dNTP濃度較低的細胞類型中逆轉錄(19)及整合進入染色體。
[0015] 祀細胞內前病毒的順式作用元件的最小化
[0016] 已經(jīng)采取了幾種手段來實現(xiàn)最小化持久地存在于祀細胞前病毒中的病毒順式作 用元件運一目標。
[0017] 首先，一些作者已經(jīng)研究了簡單的刪除和點突變來移除或失活殘留的順式作用元 件的效果。化i等人報道了對位于Gag上游的HIV-I主要剪接供體(MSD)進行點突變W及在此 基礎上進一步增加的對Gag和RRE元件的缺失產(chǎn)生了一種含有550bp HIV-I順式DNA(或 786bp，如果把前病毒中的兩個LTR也算在內的話)的轉移載體(20)。在生產(chǎn)細胞293T中運些 改變導致未剪接的轉移載體RNA的表達大幅降低，但在TE671細胞中運一效果由于細胞類型 特異性的剪接模式而不那么明顯，并且導致的滴度的降低只有2倍。運個系統(tǒng)還未被本領域 廣泛采用，可能是因為滴度下降與不常見的生產(chǎn)細胞系兩者結合。Kotsopoulou等人報道了 通過優(yōu)化包裝質粒的密碼子和從轉移載體中刪除RRE來產(chǎn)生一不依賴Rev的慢病毒載體，導 致了滴度下降了5倍(21)。自此開始報道轉移載體RNA有效包裝進病毒顆粒需要Rev/RRE系 統(tǒng)（8) Jolde j等人報道了最小化PPT上游的化f編碼序列的量(22)。該整段序列，即一直到 緊接PPT上游的5個胸腺喀晚堿基區(qū)為止似乎都是非必要的。
[0018] 第二種最小化祀細胞前病毒內的順式作用元件的手段為設計載體，其中運些元件 存在于病毒RNA基因組中但隨后在逆轉錄或整合時被刪除。
[0019] Delviks等人報道了一種gamma逆轉錄病毒載體，其中所述RNA包裝信號的兩側為 一段單純瘤疹病毒胸巧激酶基因化SV-TK)的701bp的重復序列（23)。在祀細胞內發(fā)生逆轉 錄的過程中，通過逆轉錄酶從一段重復序列到另一段的模板轉換導致了所述RNA包裝信號 的刪除。由于模板轉換不是逆轉錄酶所一定具有的活性，運種缺失的效率被報道為克隆的 91 %。運種刪除順式作用元件的策略具有的弊端是需要引入新的順式作用元件(在運里是 HSV-TK)，而其自身不被刪除。衍生自運個載體的專利和專利申請包括US5741486、 US5714353和W095/032298eSrinivasakumar在一慢病毒載體中使用了一種相似的策略，其 中所述RRE的兩側是重復的多拷貝潮霉素憐酸轉移酶基因，導致了 84%的克隆中所述RRE缺 失。
[0020] Torne-Celer等人利用逆轉錄病毒整合酶的切割內部att位點的能力來產(chǎn)生al地a 逆轉錄病毒載體，其中5 ' LTR和所述RNA包裝信號在整合的3 '末端加工過程中被病毒的整合 酶從前體整合復合物中被切掉(25)。雖然該報道中61%的克隆攜帶有預期的缺失，內部att 位點加工似乎產(chǎn)生了異質性的前病毒產(chǎn)物并且致使滴度與更常規(guī)的al地a逆轉錄病毒載體 所預期的滴度相比降低了 IO2-IO3倍(26)。
[0021] 第=種最小化慢病毒順式作用元件的手段為在轉導后從祀細胞前病毒中將它們 移除。Luche等人報道了一慢病毒載體，其中所述RNA包裝信號的兩側為IoxP位點，運樣當在 祀細胞W反式提供Cre重組酶時其可W被切除（27)。在轉導后的293T細胞中，所述切除在 12-20%的轉導細胞中能夠成功。Fang等人報道了一自我最小化的慢病毒載體，包括一Cre 重組酶表達框，其在祀細胞轉導后切割所述RNA包裝信號、RRE和其自身（28)。通過檢測Cre 表達喪失確證成功的切割在92%的祀細胞中發(fā)生。運兩種策略都依賴Cre重組酶在祀細胞 中的成功表達和發(fā)揮功能，并且運樣的一種策略在近期不太可能被批準在病人體內使用。 發(fā)明概要
[0022] 本發(fā)明的發(fā)明人通過另一種方法來尋求在祀細胞前病毒中最小化順式作用元件 W減少與把細胞內轉移載體順勢作用元件相關的弊端。
[0023] 在現(xiàn)存的慢病毒載體中，諸如所述RNA包裝信號和所述RRE的順式作用元件位于兩 個病毒的LTR之間，因此在被逆轉錄的基因組區(qū)域內。在本發(fā)明所描述的載體中，運些順式 作用元件位于所述3'LTR的下游。運些元件因此存在于病毒RNA基因組中，運樣其可被包裝 進入病毒顆粒，但在被逆轉錄的基因組區(qū)域W外，所W也不在祀細胞的載體DNA中。
[0024] 相應地，在本發(fā)明一第一方面，提供了一逆轉錄病毒載體，其包含一引物結合位 點，一長末端重復序列和一RNA包裝序列，其中所述RNA包裝序列位于所述長末端重復序列 的3'端且使得起始于所述引物結合位點的逆轉錄不會造成所述RNA包裝序列被逆轉錄進入 祀細胞內的載體DNA中。換言之，所述載體的逆轉錄導致所述RNA包裝序列被排除在祀細胞 內產(chǎn)生的逆轉錄產(chǎn)物W外。在運個載體中，無長末端重復序列位于所述RNA包裝序列的3' JLjJU 乂而。
[0025] 所述逆轉錄病毒載體可基于任何合適的能夠投送遺傳信息至真核細胞中的逆轉 錄病毒。例如，所述逆轉錄病毒載體可W是一 al地a逆轉錄病毒載體、一 gamma逆轉錄病毒載 體、一慢病毒載體或一泡沫逆轉錄病毒載體。運些載體已在基因治療和其他基因投送應用 中被廣泛使用。在一些實施方案中，所述逆轉錄病毒載體是一慢病毒載體。在一些例子中， 所述逆轉錄病毒載體可W基于HIV-I。
[0026] 所述載體包含一引物結合位點(PBS)。運個點結合一tRNA引物，所述tRNA引物負責 啟始逆轉錄過程中負義鏈合成。所述引物結合位點可位于在所述長末端重復序列的5'或3' 端的位置。優(yōu)選地，運個引物結合位點位于靠所述載體的5'末端。優(yōu)選地，所述引物結合位 點位于所述長末端重復序列5 '端一側。
[0027] 在一些實施方案中，所述載體包含一第二引物結合位點。優(yōu)選地，其位于所述長末 端重復序列化TR)的3'端一側。在一些實施方案中，運兩個引物結合位點被稱為5'引物結合 位點和3'引物結合位點。在一些實施方案中，所述第二引物結合位點位于在3'一側上緊接 所述LTR。優(yōu)選地，所述第二引物結合位點位于所述LTR和所述RNA包裝序列之間，運樣所述 RNA包裝序列位于所述第二引物結合位點的3 '端。
[0028] 所述引物結合位點結合一 tRNA引物，所述tRNA引物負責啟始逆轉錄過程中負義鏈 的合成。所述引物結合位點在所述逆轉錄過程中還為正義鏈提供了同源性。
[0029] 所述載體包含一長末端重復序列化TR)。優(yōu)選地，其位于靠所述載體的3'末端(雖 然一些組件，如所述RNA包裝序列，可能位置更靠近所述載體的3 '末端）。
[0030] 在一些實施方案中，所述載體包含兩個長末端重復序列，被稱為5'LTR和3'LTR。所 述5 ' LTR位于靠所述載體的5 '末端(盡管可能有組件更靠近5 '末端）。當存在有兩個LT則寸， 所述引物結合位點優(yōu)選地位于所述5'LTR的3'一側(但在所述3'LTR的5'一側）。所述引物結 合位點可位于3 '端一側緊接所述5 ' LTR。
[0031] 逆轉錄病毒LTR通常被片段化為U3，R和呪區(qū)。然而，在某些LTR中，運些區(qū)域中的部 分可能被刪除。術語"長末端重復序列"或LTR)意在覆蓋所有運類LTR中的變化。所述LTR參 予逆轉錄過程，運樣載體DNA在祀細胞中基于所述載體RNA產(chǎn)生。LTR可包含一些基因表達所 需的信號，如一轉錄增強子，一啟動子，一轉錄啟始信號和/或一多聚腺巧酸化信號。
[0032] 所述LTR可為一自我失活(SIN)的LTR。在所述載體中，為了提高安全性所述LTR優(yōu) 選地為一自我失活的LTR，其中U3區(qū)的核巧酸已被刪除。運可W包括TATA框和轉錄因子結合 位點。所述刪除在祀細胞中逆轉錄發(fā)生后被轉移到所述5'LTR，導致了在所述前病毒中的所 述LTR的轉錄失活。
[0033] 當所述載體包含兩個LT則寸，兩者可能都是SIN LTR。所述5'LTR的U3區(qū)可被一啟動 子替換，如巨細胞病毒(CMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子。運導致了不依賴于化t的轉錄， 但仍維持高水平的表達。如上，所述3 'LTR中的部分核巧酸已從所述U3區(qū)被刪除。SIN LTR為 本領域技術人員所熟知（例如，見Re化oviruses.Edited by Coffin JM,Hu曲es SH,and Varmus HE.Cold Spring Harbor(NY):Col