從細胞培養(yǎng)基中去除微生物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本文公開的實施方案涉及從細胞培養(yǎng)基中去除包括病毒在內的微生物的組合物 和方法。
【背景技術】
[0002] 用于蛋白生產(chǎn)的常規(guī)方法通常包括細胞培養(yǎng)方法，例如重組工程化以在生物反應 器中利用化學成分確定的細胞培養(yǎng)基產(chǎn)生所關注的蛋白（例如，單克隆抗體）的培養(yǎng)哺乳 動物或細菌細胞系。減少生物反應器被微生物如細菌、真菌、支原體和病毒污染是生物制藥 產(chǎn)業(yè)的重要問題，特別是在所關注的蛋白用于治療用途時更是如此。
[0003] 在微生物中，細菌、真菌和支原體通?？梢酝ㄟ^適當濾器過濾細胞培養(yǎng)基 來去除。例如，一般認為具有0.2 iim(um)標稱孔徑評級的微濾膜適合用于去除 Brevendumonas diminuta屬的細菌。認為具有0. lym標稱孔徑評級的膜適合用于去除 支原體，主要是萊氏無膽甾原體（Acholeplasma laidlawii)屬。參見，例如，F(xiàn)olmsbee和 Moussorakis，BioProcess International，Vol.l0，No.5,2012，pp. 60 - 62 (May 2012)。此 外，認為具有20nm標稱孔徑評級的膜適合實現(xiàn)代表最小病毒的細小病毒或細小病毒樣顆 粒的最小4對數(shù)減少。
[0004] 人們認為產(chǎn)生具有用于病毒去除的孔徑評級的膜是具有挑戰(zhàn)性的，因為減少孔徑 評級從而保留病毒可以導致膜孔的部分或完全收縮，從而使膜通透性顯著降低至不期望的 水平。此外，目前沒有特別設計用于在上游過程中有效去除病毒并可商購的膜濾器。
[0005] 通常用于細胞培養(yǎng)步驟下游的病毒屏障濾器對于去除上游病毒無效的原因之一 是由于上游和下游組合物之間的顯著差異。例如，在上游過程的情況下，細胞培養(yǎng)基中沒有 細胞或表達的蛋白。但是，存在營養(yǎng)素、脂質、氨基酸和其他組分（例如，提供流體動力學細 胞保護的普流羅尼克（Pluronic) F68)，全部是細胞生長和成活所需要的。相比之下，在下游 過程的情況下，細胞培養(yǎng)基包含細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白以及表達的蛋白。因此，在下 游過程的情況下，常使細胞培養(yǎng)基在進行病毒過濾步驟之前進行許多純化步驟以去除不期 望的病毒過濾污染物。
[0006] 值得注意的是，因為需要純化的組合物性質的差異，例如，在上游病毒去除情況 下的化學成分確定的細胞培養(yǎng)基相比在下游病毒去除情況下的包含表達的重組蛋白的細 胞培養(yǎng)基，通常在下游用于病毒去除的膜濾器在上游為了相同目的使用時往往不會工作太 好。參見，例如，Zydney et al.，Journal of Membrane Science, 297:16-50 (2007)。
[0007] 已嘗試開發(fā)病毒屏障濾器，其可以特異性地用于在上游過濾化學成分確定的細胞 培養(yǎng)基。參見，例如，Biotechnol Prog. ,16:425-434(2000)討論了用各種濾器獲得的病毒 保留結果。如這篇論文中證實的，再生纖維素濾器顯示出測試的任何濾器中最高的通量，并 且還表現(xiàn)出高病毒保留；但是，這樣的膜并不適合于目前工業(yè)中通常采用的滅菌方法，通過 適當汽蒸或通過Y輻射滅菌。雖然，這篇論文還描述了 PES濾器，但是由于其低通量，一般 認為這種濾器不適合作為病毒屏障濾器用于上游用途。
[0008] 此外，美國公開第20130344535號討論了利用超過24小時的過濾時間和利用某些 孔隙度的濾器過濾化學成分確定的細胞培養(yǎng)基以去除病毒污染物。

【發(fā)明內容】

[0009] 本文公開的實施方案提供新組合物，其用于從化學成分確定的培養(yǎng)基中去除微生 物，特別是病毒，所述化學成分確定的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)表達所關注的蛋白的細胞。因此，這 類組合物可以在將細胞培養(yǎng)基轉入生物反應器的步驟之前使用，所述生物反應器用于培養(yǎng) 細胞，例如表達所關注的重組蛋白的哺乳動物細胞。
[0010] 本文所述的組合物是基于膜的表面改性，其獲得這樣的膜，當化學成分確定的細 胞培養(yǎng)基濾過所述膜時，所述膜表現(xiàn)出被所述培養(yǎng)基中的一種或多種組分污染減少。
[0011] 在一些實施方案中，本文所述的組合物涉及具有用聚合物改性的表面的多孔膜， 所述聚合物包含隨機排列和交聯(lián)的雙丙酮丙稀酰胺（diacetone acrylamide)單體以及一 種或多種非丙稀酰胺（non-acrylamide)可交聯(lián)單體。
[0012] 在各種實施方案中，利用能源將包含隨機排列和交聯(lián)的雙丙酮丙烯酰胺單體以及 一種或多種非丙烯酰胺可交聯(lián)單體的聚合物直接包覆在多孔膜的表面上。示例性能源包括 但不限于熱、電子束、紫外光和y輻射。
[0013] 示例性非丙烯酰胺可交聯(lián)單體包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)、甘油 二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、四乙二醇二 丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯。在一具體實施方案中，非丙烯酰胺可交聯(lián)單體為 PEGDA〇
[0014] 在一些實施方案中，所述多孔膜為不對稱膜，例如，聚醚砜（PES)膜。
[0015] 本文還提供利用所述改性的多孔膜從化學成分確定的細胞培養(yǎng)基中去除病毒污 染物的方法，例如，通過所述改性的膜過濾化學成分確定的細胞培養(yǎng)基。
[0016] 在一些實施方案中，用包含以下結構的聚合物改性多孔不對稱PES膜：
[0017]
[0018] 其中，
[0019] Ml 為中性 DACm 單體：H2C = CH-C (0) -NH-C (CH3) 2-CH2-C (0) -CH3;
[0020] M2 為中性 PEGDA 單體：H2C = CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) - CH = CH2;
[0021] Ml' 為自由基化的 DACm 單體：*H2C-CH-C(0)-NH-C(CH3)2-CH2-C(0)-CH 3;
[0022] M2' 為自由基化的 PEGDA 單體：*H2C-CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) -CH-CH2*;
[0023] P指隨機聚合物網(wǎng)絡；
[0024] n = 6、7、8、9、10、11 ;并且
[0025] 符號指烯基自由基。
[0026] 在一些實施方案中，用聚合物改性多孔不對稱PES膜，所述聚合物包含以下結構：
[0027]
[0028] 其中，
[0029] Ml 和 M2 指中性 PE⑶A 單體：H2C = CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) - CH = CH2;
[0030] Ml' 和 M2' 指自由基化的 PEGDA 單體：*H2C-CH-C(0)-0-(CH2-CH2-0)n-C(0)-CH-CH 2*;
[0031] P指隨機聚合物網(wǎng)絡；
[0032] n = 6、7、8、9、10、11 ;并且
[0033] 符號指烯基自由基。
[0034] 在一些實施方案中，提供從化學成分確定的細胞培養(yǎng)基中去除一種或多種病毒污 染物的方法，其中所述方法包括以下步驟：(a)提供化學成分確定的細胞培養(yǎng)基；以及（b) 在將培養(yǎng)基轉入生物反應器之前或期間通過多孔膜過濾所述化學成分確定的細胞培養(yǎng)基， 其中所述膜具有用聚合物改性的表面，所述聚合物包含隨機排列和交聯(lián)的雙丙酮丙烯酰胺 單體以及一種或多種非丙烯酰胺可交聯(lián)單體，其中所述生物反應器內的化學成分確定的細 胞培養(yǎng)基中的一種或多種病毒污染物的水平低于通過所述改性的膜過濾所述培養(yǎng)基之前 的水平。
[0035] 在一些實施方案中，將本文所述改性的膜并入裝置。示例性裝置形式包括但不限 于圓盤（disc)、折疊筒（pleated cartridge)、卷繞式筒（spirally wound cartridge)和 多片平板（multi-plate flat sheet)。
[0036] 在一些實施方案中，所述化學成分確定的細胞培養(yǎng)基是可商購的化學成分確定的 細胞培養(yǎng)基，例如，Lonza Power CH0、CD Opti CH0、EMD Millipore Cellvento CH0 100 和 Cellvento CH0 200〇
[0037] 利用本文所述的改性的膜，化學成分確定的細胞培養(yǎng)基中的一種或多種病毒污染 物的水平降低至少lL〇gl。減少值（LRV)或至少4L 〇gl。減少值（LRV)或至少6L〇gl。減少值 (LRV)〇
[0038] 在各種實施方案中，將化學成分確定的細胞培養(yǎng)基通過本文所述的改性的膜過濾 少于24小時的時間。在一些實施方案中，在范圍為4-8的pH下和/或在范圍為20°C -25°C 的溫度下進行過濾。
[0039] 本文還提供減少病毒保留膜被化學成分確定的細胞培養(yǎng)基中的一種或多種組分 污染的方法，所述方法包括以下步驟：(a)提供病毒保留膜；以及（b)用包含隨機排列和交 聯(lián)的雙丙酮丙烯酰胺單體以及一種或多種非丙烯酰胺可交聯(lián)單體的聚合物改性所述膜，其 中相對于未改性的膜，改性的膜被化學成分確定的細胞培養(yǎng)基中的一種或多種組分污染減 少。
[0040] 在一些實施方案中，病毒保留膜是基于PES膜、PVDF膜、纖維素膜或尼龍膜。
[0041] 在一些實施方案中，非丙烯酰胺可交聯(lián)單體為聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)。
【附圖說明】
[0042] 圖1的條形圖示出利用CH0細胞培養(yǎng)基作為進料流，有或無普流羅尼克F68暴露 的雙丙酮丙烯酰胺（DACm)均聚物改性的PES膜的處理量性能結果。前5個數(shù)據(jù)集代表如 通過V75(L/m 2)、V90(L/m2)和10X通透性（L/m2h psi)測量的，利用不同百分比的DACm溶 液（2%、4%、6%、8%和10%)改性的膜的膜性能；而后5個數(shù)據(jù)集代表也通過￥75〇7111 2)、 V90(L/m2)和10X通透性（L/m2h psi)測量的，有F68暴露的相同膜的膜性能。
[0043] 圖2示出一式兩份測試的，包含4% DACm-1 % MBAm改性的PES膜或4% DACm-1 % PEGDA改性的PES膜或1 % HPC改性的PES膜（作為對照）的膜裝置的通量衰減曲線。Y-軸 代表表示為（J/J。）％百分比的通量衰減，該百分比是基于對非阻塞性或非污染性進料流 (例如，Milli-Q水）確定的通量J。的百分比；而X-軸代表通過每平方米膜收集的濾液的 升數(shù)（L/m 2)表示的膜的處理量或容量。
[0044] 圖 3 的條形圖示出 4% DACm-1 % MBAm、4% DACm-1 % PEGDA 和 1 % HPC(作為對 照）表面改性的PES膜的容量和通透性。CH0細胞化學成分確定的細胞培養(yǎng)基用作進料流。 X-軸代表膜，而 Y-軸代表 V75 (L/m2)、V90 (L/m2)和 10X 通透性（L/m2h psi)。
[0045] 圖4的條形圖示出測試的各種膜裝置的平均容量和通透性，為測量的V75、V90 和10X通透性。構建每個膜裝置以容納各種表面改性的膜中每種的單層（1L-)。1%HPC 指單層膜裝置，其具有通過浸沒施用的吸附聚合物預處理，并且包含1. 〇〇重量（Wt) %羥 丙基纖維素（HPC)水溶液，以10%己二醇用作膜濕潤助劑；3. 75% LB20指單層膜裝置， 其具有通過原位電子束固化以3. 75%的濃度施用的自交聯(lián)的高度乙氧基化的三丙烯酸 酯單體；4.00 % -DACm-1 % MBAm指單層膜裝置，其具有單官能團的乙烯基單體4 %雙丙 酮丙烯酰胺（DACm)，以及與DACm形成共聚物的二丙烯酰胺交聯(lián)劑1 %亞甲基-雙-丙 烯酰胺（MBAm) ;2. 00 % LB20-1 % HEA-0. 75 % TEGDA 指單層膜裝置，其具有 2 % LB20， 1%丙烯酸羥乙酯（HEA)以及0.75%四乙二醇二丙烯酸酯（雙官能團或交聯(lián)單體）；而 4. 00% -DACml% -PEGDA575 指單層膜裝置，其具有 4% DACm 和 1% PEGDA575，PEGDA575 為 575數(shù)均分子量（Mfft)的聚乙二醇二丙烯酸酯。
[0046] 圖5示出的圖代表一式兩份測試的每種單層膜裝置的平均體積對時間的曲線。測 試的膜裝置為HPC ;3. 75% LB20 ;4. 00% DACm-1% MBAm ;2. 00% LB20-1% HEA-0. 75% TEGDA ;和4.