一種硫酸軟骨素聚電解質(zhì)納米粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質(zhì)納米粒的制備方法，屬于硫酸軟骨素領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]硫酸軟骨素是從豬、牛、雞和鳘魚的軟骨中提取的一種由D-葡萄糖酸酸和N-乙醜-D-半乳糖胺組成的酸性粘多糖，常溫下為白色粉末，無臭，無味，吸水性強，易溶于水而成粘度大的溶液，遇較高溫度或酸即不穩(wěn)定。它具有抗凝血和抗血栓作用，臨床用于治療冠狀動脈硬化、血脂和膽固醇增高、心絞痛、神經(jīng)痛、心肌缺血和心肌梗塞等癥。
[0003]目前，國內(nèi)外硫酸軟骨素的提取多來自豬軟骨、豬喉骨、雞胸軟骨；?；蜓虮枪恰⒑砉?、軟肋、氣管、月牙骨以及各部位的雜軟骨;魚軟骨、蛋殼膜等。硫酸軟骨素主要利用動物提取法和發(fā)酵法進行提取制備。
[0004]普通軟骨素產(chǎn)品存在分子量波動大、口服吸收差、生物利用度低、療效不穩(wěn)定等缺點。有實驗表明，中低分子量的硫酸軟骨素產(chǎn)品的體內(nèi)吸收均明顯優(yōu)于普通分子量的產(chǎn)品，分子量越小吸收率越高。硫酸軟骨素的生物活性隨分子量不同而各異，其藥理活性與分子量有著密切的關(guān)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前普通軟骨素產(chǎn)品存在分子量波動大、口服吸收差、生物利用度低、療效不穩(wěn)定，而且提取的硫酸軟骨素收率不高、質(zhì)量不穩(wěn)等問題，提供了一種高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質(zhì)納米粒的制備方法，本發(fā)明先將雞軟骨進行酶解去除表面的雜蛋白，再堿溶、醇沉得硫酸軟骨素，加入殼聚糖后硫酸軟骨素采用聚電解質(zhì)復合法制備聚電解質(zhì)納米粒，本發(fā)明制備得到的聚電解質(zhì)納米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高，而且該方法操作簡單，殼聚糖和硫酸軟骨素室溫條件下即可在水相內(nèi)完成聚電解質(zhì)納米粒的制備，硫酸軟骨素質(zhì)量好，收率高，在制備中加入凍干保護劑，不僅可以提高電解質(zhì)納米粒的溶解性和穩(wěn)定性，而且可以控制其納米粒徑不易變大、從而進一步提尚穩(wěn)定性。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)稱取I?2kg雞軟骨用去離子水沖洗3?5遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相應(yīng)體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為
0.5mol/L乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.5?2.5 ；
(2)當pH調(diào)至預設(shè)值時，加入酶解底物總質(zhì)量0.5?0.7%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30?40°C下保溫酶解7?9h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再經(jīng)研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素；
(3)將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質(zhì)量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40?45°C水浴鍋中，保溫浸提5?6h后用臥式離心機以4000?5000r/min離心20?30min，分離去除下層沉淀得到上清液；
(4)用濃度為0.3moI/L鹽酸調(diào)節(jié)上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液總體積I/20的質(zhì)量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200?300W功率超聲振蕩反應(yīng)I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經(jīng)高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素；
(5)稱取10?20g殼聚糖溶于500?100mL質(zhì)量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取10?20g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500?100mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液；
(6)將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min轉(zhuǎn)速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌5?1min形成均一的混懸液；
(7)向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質(zhì)量占10%，海藻酸鈉質(zhì)量占5%，放入高剪切分散機中分散均勻，再經(jīng)真空凍干機于-40?-30°C下凍干后粉碎并過200目標準篩，即得高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質(zhì)納米粒。
[0007]本發(fā)明的應(yīng)用的方法:分別配制180?200mL的模擬人工胃液和120?150mL pH4.0的磷酸鹽緩沖液作為透析介質(zhì)分別置于錐形瓶中備用，取0.3?0.Sg本發(fā)明制備的聚電解質(zhì)納米粒取置于截留分子量為10000的透析袋中，分別將裝有載藥聚電解質(zhì)納米粒的透析袋置于盛有人工胃液和磷酸鹽緩沖液的透析介質(zhì)錐形瓶中，采用恒溫振蕩水浴法，在35?37°C溫度和130?150r/min振蕩頻率條件下，振蕩10?12h，每隔Ih取透析外液3?5mL，采用紫外分光光度法進行測量，計算累計釋放率，3.5h后達到75%以上釋放率，24h釋放率可達到95%以上。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明制備得到的聚電解質(zhì)納米粒生物相容性好、分子量小、口服吸收效果好、生物利用率高；
(2)本發(fā)明操作方法簡單，殼聚糖和硫酸軟骨素在室溫條件下即可在水相內(nèi)完成聚電解質(zhì)納米粒的制備，發(fā)展前景廣闊，在制備中加入凍干保護劑，不僅可以提高電解質(zhì)納米粒的溶解性和穩(wěn)定性，而且可以控制其納米粒徑不易變大。
【具體實施方式】
[0009]稱取I?2kg雞軟骨用去離子水沖洗3?5遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1:5向罐中加入相應(yīng)體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為0.5mol/L乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.5?2.5 ；當pH調(diào)至預設(shè)值時，加入酶解底物總質(zhì)量0.5?0.7%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30?40°C下保溫酶解7?9h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105?110 °C下干燥I?2h，再經(jīng)研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素;將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質(zhì)量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40?45°C水浴鍋中，保溫浸提5?6h后用臥式離心機以4000?5000r/min離心20?30min，分離去除下層沉淀得到上清液；用濃度為0.3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上述上清液pH至5.5?6.5，加入上清液總體積1/20的質(zhì)量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200?300W功率超聲振蕩反應(yīng)I?2h后移入4?6°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經(jīng)高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素;稱取10?20g殼聚糖溶于500?100mL質(zhì)量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取10?20g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500?100mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液;將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600?700r/min轉(zhuǎn)速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15?20min內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌5?1min形成均一的混懸液；向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質(zhì)量占10%，海藻酸鈉質(zhì)量占5%，放入高剪切分散機中分散均勻，再經(jīng)真空凍干機于-40?-30 0C下凍干后粉碎并過200目標準篩，即得高得率以及高生物利用度硫酸軟骨素聚電解質(zhì)納米粒。
[0010]實例 I
稱取Ikg雞軟骨用去離子水沖洗3遍，用刀切除鈣化的部分，洗凈后將雞軟骨放入陶瓷酶解罐中，按料液比1: 5向罐中加入相應(yīng)體積的蒸餾水，得酶解底物，用濃度為0.5mo I/L乙酸溶液調(diào)節(jié)PH至1.5;當pH調(diào)至預設(shè)值時，加入酶解底物總質(zhì)量0.5%的胃蛋白酶，攪拌均勻后移入恒溫箱，在30°C下保溫酶解7h，過濾分離得到酶解去除雜蛋白后的雞軟骨，放入烘箱中在105°C下干燥lh，再經(jīng)研缽研磨后過40目標準篩，得到去雜雞軟骨素;將上述得到的去雜雞軟骨素按料液比1:6和質(zhì)量濃度為10%氫氧化鈉溶液進行混合，移入40°C水浴鍋中，保溫浸提5h后用臥式離心機以4000r/min離心20min，分離去除下層沉淀得到上清液；用濃度為0.3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上述上清液pH至5.5，加入上清液總體積1/20的質(zhì)量濃度為4%乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻后再加入混合液總體積2/3的無水乙醇，放入超聲振蕩儀以200W功率超聲振蕩反應(yīng)Ih后移入4°C的冰水浴中，靜置沉淀過夜，經(jīng)高速離心機離心分離后干燥，得到硫酸軟骨素;稱取1g殼聚糖溶于500mL質(zhì)量濃度為10%醋酸溶液中，得殼聚糖溶液，再稱取1g上述制得的硫酸軟骨素，溶于500mL蒸餾水，配制得硫酸軟骨素溶液;將上述制得的硫酸軟骨素溶液逐滴滴入以600r/min轉(zhuǎn)速攪拌中的殼聚糖醋酸溶液中，控制滴加速度使其15min內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌5min形成均一的混懸液；向上述混懸液中加入其體積1/10葡萄糖和海藻酸鈉混合液作為保護劑，所述混合液中葡萄糖質(zhì)量占10%，海藻酸鈉質(zhì)量占5%，放入高剪