] 培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速180 r/min、28°C搖床培養(yǎng)18 h，作為種子液備用。
[0031] (2)B肥1發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基：薦糖20 g，NH4N〇3 2 g，K此P〇4 3 g，化抽P〇4 10 g，MgS〇4 ? 7此0 0.2 g，酵母粉 0.2邑，CaCl2 0.7yg，MnS04?4出0 1yg，蒸饋水 1000 mL，pH7.0~7.2。
[0032] 培養(yǎng)條件:發(fā)酵培養(yǎng)基100血裝于250mLS角瓶中，接種3%的種子菌液，轉(zhuǎn)速180 r/ min、32°C在搖床發(fā)酵培養(yǎng)72h。該培養(yǎng)液中活菌數(shù)為SXlO7C化/ml,可W用于進(jìn)行抗生物質(zhì) 的分析和番茄灰霉病的防治。
[0033] 實施例6甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌B肥1的脂膚類抗生物質(zhì)的PCR鑒定 采用與ituA，i1:uB，ituC，i1:uD ^6]18,94^6]1〇,3計48,6曰1]1〔，313〇4和7]1(1]"基因相關(guān)的弓| 物，對篩選的保藏號為CGMCCNo. 11840的菌株進(jìn)行菌體PCRdPCR反應(yīng)條件:25山反應(yīng)體系化I 培養(yǎng)1地的菌液，2.5iil IOXPCR緩沖液，dNTPs各0.2 mmol/L，上下游引物各0.5皿〇1/ 1，1.25 111'日9〇臟聚合酶巧日4日招，1)日11日]1)。擴增;[1：114，;[1:地，;[1：110，3計48^6]16和化基因 的程序為：94°C5 min，94°Cl min，58°Cl min，72°Cl 111111，35個循環(huán)，72°(：延伸1〇111111;擴增 bamC，fenD，ituC，sboA和yndj基因程序為：94°C 5 min，94°C30 s，52°C30 s，72°Cl min, 35個循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，染色劑為GoldView。由圖6 (M:分子量標(biāo)記物（DM2000);泳道1 :yndj ;泳道2 : sboA;泳道3 :bamC;泳道4: ituC;泳道5 : fenD;泳道6 :化;泳道7: ituB;泳道8: ituD;泳道9: ituA;泳道10 :fenB;泳道11: s;rfAB)可見 甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌B肥1可能含有ynd j、i 1:uC、、f enD、i tuB、i 1:uD、ituA、srfAB基因，它們分 別為Itu;rin、Fengycin、Sufactin和化dj的生物合成相關(guān)基因。擴增產(chǎn)物交由上海立菲 生物技術(shù)有限公司純化測序，核酸序列通過NCBI提供的GenBank的BLAST(http:// blast .ncbi .nlm.nih. gov/Blast. Cgi進(jìn)行在線比對相似度，如表1。其中FNDF1/FNDR1 引物 擴增片段與fengycin合成相關(guān)，相似度為100%;而引物ituD2F/iUiD2R，iUiAlF/ituAlR和 ITUCF1/ITUCR3引物擴增片段表現(xiàn)為96-99%的相似度，都與iturin家族脂膚類抗生物質(zhì)相 關(guān)。引物10F/110R和147F/147R擴增片段與目的基因擴增片段相似度都達(dá)到96%，說明菌株 B肥1具有表達(dá)SUrfactin和ynd j活性的能力（表1)。
[0034] 表1 PCR產(chǎn)物核酸序列與相關(guān)基因的相似度
[0035] 實施例7甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌B肥I的脂膚類抗生物質(zhì)的色譜分析 脂膚類抗生物質(zhì)的粗制備 搖瓶發(fā)酵72 h后的發(fā)酵液9000 r/min離屯、30 min去除菌體。無菌上清液用鹽酸調(diào)節(jié) pH至2.0。4 °C冰箱過夜使沉淀過程完全。9000 r/min離屯、10 min,收集沉淀，將沉淀用凍 干機凍干，得到脂膚粗提物。將脂膚粗提物用適當(dāng)甲醇溶解，離屯、取上清，用于下一步色譜 分析。
[0036] 脂膚類抗生物質(zhì)的色譜分析 采用的色譜柱為 waters Xbridge Peptide BEHC18,300A，5um。流動相：0.1 細(xì) FA Water，0.1%HFA乙臘。洗脫條件為0.1%HFA乙臘(0%一 100%)，梯度洗脫80min。檢測波長采 用PM檢測器215nm波長掃描。流速為Iml/min，進(jìn)樣量為200ug，柱溫為30°C。為驗證發(fā)酵產(chǎn) 物的穩(wěn)定性，檢測3個不同批次發(fā)酵液。由圖7可看出甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌BH21發(fā)酵液含有 Iturin類、Fengycin類、Sufactin類脂膚類抗生物質(zhì)，并且3個批次間色譜峰分布基本一致。
[0037] 實施例8甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌B肥1在番茄葉片上的離體防效試驗 取大小相對一致的盆栽番茄健康葉片，先用無菌水正反沖洗一次，再用75%酒精沖洗 2min，之后用無菌水沖洗3次，去除殘余酒精。用移液器分別將稀釋10倍、20倍、50倍、100倍、 200倍的括抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液對葉片進(jìn)行沖洗，使整個葉片沾滿發(fā)酵液，W無菌水處理做對 照。分別接種直徑8 mm的灰霉病菌菌塊，將葉片置于無菌培養(yǎng)皿中保濕，22°C溫室培養(yǎng)，7 d 后測量葉片病斑直徑，記錄結(jié)果。
[0038] BH21發(fā)酵上清液稀釋液處理番茄葉片，上述各濃度的處理對灰霉病的防效分別為 100%、100%、100%、100%和92%。結(jié)果表明，BH21發(fā)酵上清液對灰霉病菌有很強的抑制作用，在 番茄離體葉片上對灰霉病有很好的防治效果。
[0039] 實施例9甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌BH21對室內(nèi)盆栽番茄灰霉病的防效試驗 室內(nèi)盆栽番茄幼苗，待長出3-4片真葉時供試。用噴壺定量噴施各個稀釋度（10倍、50 倍、100倍、200倍)的發(fā)酵上清液，無菌水噴施為空白對照，喀霉胺(有效成分含量2%，1000倍 稀釋)作為常用的藥劑對照，每處理20株，每株3 m L，自然驚干，24 h后用噴壺接種1〇7 C化 / m L灰霉菌抱子懸浮液5 m L。接種后用保鮮袋將番茄幼苗保濕，置于(22±1)°C(RH=90%) 光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，待空白對照病情指數(shù)達(dá)40%時，計算各處理的防效，結(jié)果見表2。
[0040]病情指數(shù)=[2 (各級病葉數(shù)X相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)X9)] X 100 防效(％)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]X100 盆栽實驗中，BH21各個濃度的發(fā)酵濾液均對灰霉病有一定的防治效果，發(fā)酵濾液100 倍稀釋液的防病效果最好，病情指數(shù)為1.2，防效為97.0%。
[0041 ]表2 BH21發(fā)酵液與農(nóng)藥處理番茄的病情指數(shù)和防病效果
[0042] 實施例10甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌BH21防治番茄灰霉病的田間應(yīng)用效果 于番茄棚室中進(jìn)行防治番茄灰霉病的田間應(yīng)用實驗，實驗設(shè)置3個處理：空白對照、甲 基營養(yǎng)型芽抱桿菌BH21發(fā)酵液100倍稀釋和喀霉胺1000倍稀釋液，不同處理間采用塑料薄 膜隔開，W避免不同處理間的相互影響，便于實驗結(jié)果統(tǒng)計?？瞻讓φ詹蛔鋈魏翁幚?發(fā)酵 液噴施處理于番茄現(xiàn)蕾期開始間隔15天噴施一次(噴施量約每公頃IL原始發(fā)酵液）；喀霉胺 依照當(dāng)?shù)夭宿r(nóng)的應(yīng)用經(jīng)驗，在番茄灰霉病出現(xiàn)發(fā)病跡象的時候開始噴施，之后根據(jù)病情間 隔7-10天噴施一次。待空白對照病情指數(shù)達(dá)到50%W上時，統(tǒng)計其他處理番茄葉霉病的病情 指數(shù)及防病效果，結(jié)果見表3。
[0043] 表3 BH21處理田間番茄灰霉病的病情指數(shù)和防病效果
[0044] W上僅為本發(fā)明的較佳實施方式，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于W上描述 的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何不具有創(chuàng)造性的改進(jìn)，如將發(fā)酵液按照常規(guī) 方法制成各種微生物菌劑等，也都在本發(fā)明的保護(hù)范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神 和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)多種脂肽類抗生物質(zhì)的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，該甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌于 2015年12月09日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行了保藏，保藏號為 CGMCC No.11840。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，其特征在于：其16sRNA序列在 Genebank的登錄號為KT889363,其gyrB基因序列在Genebank的登錄號為KT889364。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，其特征在于:其含有產(chǎn)生脂肽類抗 生物質(zhì)的基因，包括：!^1^、;[1：1113、;[1：11(]、;[1：11〇，€611〇,8奸厶13和711(11基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌服21，其特征在于：其產(chǎn)生Iturin類、 Fengycin類、Sufactin類和Yndj類脂肽類抗生物質(zhì)。5. 權(quán)利要求1-4任一項所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21的應(yīng)用，其特征在于用于防治 番前灰霉病。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21的發(fā)酵液 用于生物防治，所述發(fā)酵液由以下步驟制得:按體積比3%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接種 到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)72h，得到發(fā)酵液，即可用于生物防治。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述種子液通過下述方法獲得:將保存的 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21劃線轉(zhuǎn)接到ZoBell's 2216E培養(yǎng)基平板中，置于培養(yǎng)箱28°C恒溫 培養(yǎng)2天;將獲得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21的菌苔接種到PB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振 蕩培養(yǎng)18h得到種子液。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的大量發(fā)酵培養(yǎng)基中包含:蔗糖20 g， NH4NO3 2 g，KH2P〇4 3 g，Na2HP〇4 10 g，MgS〇4· 7H20 0.2 g，酵母粉 0.2 g，CaCl2 0.7 yg， 11^〇4.紐2〇14區(qū)，蒸餾水100〇11^4!17.0~7.2。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:制備發(fā)酵液時轉(zhuǎn)速為180 r/ min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)多種脂肽類抗生物質(zhì)的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21，其保藏號為CGMCCNo.11840，該菌株能產(chǎn)生Iturin類、Fengycin類、Sufactin類和Yndj類脂肽類抗生物質(zhì)，本發(fā)明還提供了該菌株在防治番茄灰霉病中的應(yīng)用，其對番茄灰霉病菌有良好的防效。該菌株及其微生物制劑的使用，可以降低番茄生產(chǎn)過程中化學(xué)農(nóng)藥的施用，具有良好的生態(tài)和社會效益。CGMCC No.1184020151209
【IPC分類】C12N1/20, A01P3/00, A01N63/02, C12R1/10
【公開號】CN105713858
【申請?zhí)枴緾N201610126777
【發(fā)明人】魏新燕, 段普凡, 賈振華, 黃亞麗
【申請人】河北省科學(xué)院生物研究所
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2016年3月7日