短雙歧桿菌及牛奶中多種抗生素殘留的檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)和食品安全領(lǐng)域;設(shè)及一株短雙歧桿菌及利用該菌株進(jìn)行牛 奶中抗生素殘留的快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛奶安全不僅關(guān)系到廣大人民群眾的健康，也是乳品企業(yè)的命脈。牛奶中抗生素 殘留是牛奶安全的一個(gè)重要問題。隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高。為預(yù)防 疾病和治療乳房炎等疾病，抗生素類獸藥在畜牧業(yè)的應(yīng)用日益廣泛，在應(yīng)用抗生素治療奶 牛疾病在取得效果的同時(shí)，不規(guī)范使用抗生素如增加使用劑量和延長(zhǎng)治療期，甚至給泌乳 期奶牛長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素預(yù)防疾病等使牛奶中不僅存在抗生素殘留，而且往往是殘留抗生素 含量較高。
[0003] 我國(guó)許多乳制品不符合需進(jìn)口國(guó)家和地區(qū)的要求，其中抗生素殘留超標(biāo)是重要限 制因素。牛奶中抗生素殘留不僅給牛奶生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來?yè)p失，同時(shí)也對(duì)消費(fèi)者的身體 健康帶來諸多潛在的危害。隨著人民生活水平的提高和對(duì)生物安全和食品安全的重視，抗 生素殘留已成為牛奶食品安全中全社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)。為適應(yīng)國(guó)內(nèi)外日益嚴(yán)格的要求，W及 市場(chǎng)和進(jìn)出口快速通關(guān)的需要，建立一種簡(jiǎn)單、快速、有效檢測(cè)牛奶中多種抗生素殘留的方 法具有重要意義。
[0004] 有關(guān)文獻(xiàn)或方法中多種抗生素藥物殘留的檢測(cè)方法基本上是對(duì)每一類藥物進(jìn)行 分別檢測(cè)，分析方法包括色譜法、色/質(zhì)聯(lián)用法、薄層色譜、免疫測(cè)定法和微生物抑制法等。 我國(guó)常用橫胺類、哇諾酬類、e-內(nèi)酷胺類、四環(huán)素類、氯霉素類共5大類33種獸藥的藥物，其 化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)差異較大，不易同時(shí)檢測(cè)。同時(shí)對(duì)牛奶中多種抗生素殘留進(jìn)行檢 測(cè)有一定困難，目前我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 4789.27-2008)中規(guī)定TTC法檢測(cè)牛奶中抗生 素殘留，該法設(shè)備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低，但靈敏度低、易假陽(yáng)性，在檢測(cè)青霉素和氯霉素上敏感度與 枯草桿菌紙片法大致相等，但對(duì)鏈霉素不太敏感，對(duì)新霉素不敏感，消毒劑可干擾試驗(yàn)。
[0005] 微生物抑制法操作簡(jiǎn)便，儀器設(shè)備和人員要求均不高，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間 短等特點(diǎn)，一直被用于大批量樣品的過篩。本發(fā)明主要應(yīng)用對(duì)e-內(nèi)酷胺類、大環(huán)內(nèi)醋類、四 環(huán)素類敏感的益生菌，建立一種快速篩檢和定量檢測(cè)青霉素、紅霉素和四環(huán)素的微生物抑 制法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是篩選出不易被雜菌污染影響并對(duì)殘留抗生素敏感的雙歧桿菌菌 株，并由此建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的W該菌株為工作菌株進(jìn)行牛奶中抗生素殘留檢測(cè)的 篩選和定量檢測(cè)方法，該方法采用殘留抗生素對(duì)菌株的生長(zhǎng)抑制作用來確認(rèn)牛奶中是否有 抗生素殘留是否超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可有效檢測(cè)牛奶中殘留抗生素存在狀況及含量。
[0007] 本發(fā)明提供一株對(duì)0內(nèi)酷胺類抗生素敏感的并應(yīng)用于牛奶中抗生素殘留檢測(cè)的短 雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)DSQH-l。
[000引本發(fā)明的短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)DSQH-l，于2013年12月13日保藏 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，其簡(jiǎn)稱為CGMCC(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve),保藏編號(hào)為CGMCC No.8579。
[0009] 本發(fā)明的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)DSQH-1分離自一名浙江省母乳喂 養(yǎng)兒童(男性)糞便。
[0010] 本發(fā)明的短雙歧桿菌DSQH-I菌株具有W下微生物學(xué)特征：
[0011] (1)菌落形態(tài):短雙歧桿菌DSQH-I菌株在TPY固體平板上的菌落直徑1.2-1.5mm、圓 形、凸起、邊緣整齊、乳白色、不透明，具有光澤，質(zhì)地柔軟、細(xì)膩；
[0012] (2)菌體形態(tài):革蘭染色陽(yáng)性無芽抱桿菌，菌體呈棒桿狀，一端或兩端膨大，有彎曲 或分叉現(xiàn)象，形成特有的"Y"、"V"形結(jié)構(gòu)。
[0013] (3)生理生化特征:觸酶陰性，分解葡萄糖、薦糖、麥芽糖、果糖和半乳糖，不分解淀 粉、纖維二糖、心阿拉伯糖、木糖、海藻糖、菊糖，硝酸鹽還原陰性，說基質(zhì)試驗(yàn)陰性。
[0014] (4)培養(yǎng)特征:厭氧生長(zhǎng)良好，有氧不生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度37°C-42°C，最低生長(zhǎng)溫 度25°C，最高生長(zhǎng)溫度45°C ;最適P冊(cè).5-7.0，pH低于5.0或高于8.0不生長(zhǎng)。
[0015] 本發(fā)明還提供一種牛奶中抗生素殘留的快速檢測(cè)方法，所述方法包括W下步驟：
[0016] (1)菌株活化:將權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌DSQH-I菌株接種于TPY固體培養(yǎng)基， 37 °C培養(yǎng)24-4化；
[0017] (2)菌懸液制備：取步驟（1)所得的短雙歧桿菌DSQH-I菌株TPY液體中，37 °C、 200rpm震蕩培養(yǎng)4-5小時(shí)，3000rpm離屯、5分鐘，用PBS調(diào)整菌液0D600的值為0.15-0.20，4°C 保存；
[001引（3)篩檢培養(yǎng)基制備：W重量計(jì)，取蛋白腺，2.5g，酵母浸膏3.Og,葡萄糖4.Og,可溶 性淀粉l.Og，氯化鋼l.Og，牛肉膏l(xiāng).0g，K2HP04 0.6g，K此P04 0.6g，吐溫-80 O.lmL，蒸饋水 I OOmL。加入黃豆浸液300血，調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8,分裝每管10ml，包裝后115 °C高壓滅菌15-20 分鐘，冷卻后置4 C保存、備用；
[0019] (4)定量檢測(cè)培養(yǎng)基制備，W重量計(jì)，取蛋白腺lOg，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸 鋼5g，K2HP〇4 2g，MgS〇4.7出0 0.5g，MnS〇4.4此0 0.2g，低聚果糖3g，巧樣酸二錠2g，吐溫-80 IML，用1000 mL蒸饋水溶解，調(diào)節(jié)抑至6.5-6.8，分裝每管19.5血，包裝后115 °C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻后置4 C保存、備用；
[0020] (5)標(biāo)準(zhǔn)管制備:取青霉素、四環(huán)素和紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用抑8.0憐酸鹽緩沖液稀 釋配制成不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液;氨節(jié)青霉素10化g/L、50yg/L、4化g/L、20yg/L、l化 邑/1、5蛇/1、4蛇/1、2蛇/1、1雌/1的標(biāo)準(zhǔn)工作液；四環(huán)素500蛇/1、45化旨/1、400蛇/1、35化邑/ 1^、300蛇/1、250蛇/1、200蛇/1、15化旨/1、100蛇/1、50蛇/1的標(biāo)準(zhǔn)工作液;紅霉素100蛇/1、80 iig/L、60iig/L、40iig/L、20iig/L、1 Oiig/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;4 °C 冷藏備用；
[0021] (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:取步驟(3)制備的定量檢測(cè)培養(yǎng)基，分別加入步驟(5)不同濃度 的抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液40化L，W化g/L為生長(zhǎng)對(duì)照?；靹蚝蠹尤氩襟E(2)制備的菌液10化L，混 勻后40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時(shí);測(cè)定600nm波長(zhǎng)下各濃度檢測(cè)管的吸光度值，W標(biāo)準(zhǔn)系列管 中加入抗生素濃度值為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] (7)樣品準(zhǔn)備:取樣品IOmL于無菌試管中，80°C水浴30分鐘；
[0023] (8)樣品檢測(cè):篩檢取步驟(7)所得的樣品，等體積加入到步驟(4)所得的篩檢檢測(cè) 管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)6-8小時(shí)；牛奶出現(xiàn)凝固或出現(xiàn)紅色為抗生素 殘留低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，不凝固、呈黃色為抗生素殘留超標(biāo)。定量檢測(cè)取步驟(7)所得的樣品，加 入到步驟(4)所得的檢測(cè)管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)12-16小時(shí)；W培養(yǎng) 基調(diào)零，測(cè)定樣品管陰性對(duì)照管的0D600,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取抗生素濃度值(iig/L)。
[0024] 本發(fā)明的工作菌株為短雙歧桿菌DSQH-I，保藏編號(hào)為CGMCC No.8579。
[0025] 本發(fā)明所述的牛奶樣品包括:液態(tài)乳、復(fù)原乳。
[0026] 本發(fā)明所述的氨節(jié)青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過下述方法得到:利用氨節(jié)青霉素儲(chǔ)備液 配制濃度分別為 1 〇〇yg/L、50yg/L、40yg/L、20yg/L、10yg/L、扣g/L、化g/L、化g/L、化 g/L的標(biāo) 準(zhǔn)工作液，W化g/L為陰性對(duì)照。取各濃度的氨節(jié)青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液40化L加入到19.5mL的 定量檢測(cè)培養(yǎng)基中混勻，再加入檢測(cè)菌液10化L，40°C厭氧培養(yǎng)12-1化，測(cè)定600nm波長(zhǎng)下各 濃度檢測(cè)管的吸光度值，W抗生素濃度值為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得 到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = -166.72X+95.431(Y:樣品中氨節(jié)青霉素濃度iig/L，X:反應(yīng)管的 0D600值），線性范圍為l-100yg/L，R2為0.9941。
[0027] 本發(fā)明所述的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過下述方法得到:利用四環(huán)素儲(chǔ)備液配制濃度 分別為50yg/L、100yg/L、150yg/L、200yg/L、250yg/L、300yg/L、350yg/L、400yg/L、450yg/L、 500yg/L的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，W〇yg/L為陰性對(duì)照。方法同前，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y 二-858.84X+461.7(Y:樣品中四環(huán)素濃度yg/L，X:反應(yīng)管的0D600值），線性范圍為50-500y g/L，R2 為0.9944。
[0028] 本發(fā)明所述的紅環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲