僅為物理吸附。帶有黃曲霉素解毒酶基因的酵母菌體處理黃曲霉素時(shí)，黃曲霉素減少幅 度都高于對照菌株。說明菌體中的黃曲霉素解毒酶發(fā)揮了作用。
[0088] 表2轉(zhuǎn)化子和對照菌株處理黃曲霉素的效果
[0089]
[0090] 實(shí)施例4
[0091] 構(gòu)建來源于Armillariella t油escens的黃曲霉素解毒酶的酵母菌株
[0092] 根據(jù)報(bào)道的來源于Armillariella t油escens的黃曲霉解毒酶序列（中國生物工 程雜志2011,31(4) :71-76 ;中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2007,9(5) :87-94), W全基因合成的方法， 獲得合成編碼黃曲霉素解毒酶的完整ORF序列（參見CN200410051120. 0,圖1和圖2)。
[0093] W Gibson assembly法，將黃曲霉素解毒酶基因連入pCpAl/G-XI載體值iao et al. BMC Biotechnology 2013, 13:110)并替代pCpAl/G-XI載體中的XI基因，獲得的質(zhì)粒命 名為pCpAl-HQ2。經(jīng)測序確定序列無誤。黃曲霉素解毒酶基因位于TPIl啟動子和CYCl終 止子之間。
[0094] 將pCpAl-HQ2轉(zhuǎn)入釀酒酵母CICC1300(CICC為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中 屯、，化ina Center of Industrial Qilture Collection),從而獲得幾十株帶有來源于 Armillariella t油escens的黃曲霉解毒酶的釀酒酵母菌株轉(zhuǎn)化子。獲得的轉(zhuǎn)化子中，TPIl 啟動子-黃曲霉素解毒酶基因-CYCl終止子運(yùn)一單元，整體插入染色體的ARGl位點(diǎn)。TPIl 啟動子可W啟動黃曲霉素解毒酶的組成型表達(dá)。對于轉(zhuǎn)化子菌落經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證的、帶 有黃曲霉素解毒酶基因的五個轉(zhuǎn)化子，分別命名為冊21，冊22,冊23,冊24,冊25。 陽0巧]實(shí)施例5
[0096] 帶有Armillariella t油escens黃曲霉素解毒酶活性的酵母可發(fā)酵（酶變）糧食 為乙醇
[0097] 采用實(shí)施例4構(gòu)建的冊21、冊22、冊23、冊24、冊25和對照菌株CICC1300,進(jìn)行乙 醇發(fā)酵。
[0098] W未檢出黃曲霉毒素的原料，按照文獻(xiàn)（玉米生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究，食品與 發(fā)酵工業(yè)，2008年02期）制作培養(yǎng)基并進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇的搖瓶試驗(yàn)。（同實(shí)施例2)。在 發(fā)酵開始前，向培養(yǎng)基中添加 lOmg/L黃曲霉素。96小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，各菌株乙醇產(chǎn)量基本 相同。
[0099] 檢測發(fā)酵前后黃曲霉素 Bl含量。如表3所示，對照菌株組黃曲霉素僅降低7. 2%， 原因可能是菌體的物理吸附作用和自發(fā)降解。帶有黃曲霉素解毒酶基因的酵母菌體，黃曲 霉素減少幅度都高于對照菌株，說明菌體中的黃曲霉素解毒酶發(fā)揮了解毒作用。
[0100] 表3轉(zhuǎn)化子和對照菌株進(jìn)行乙醇發(fā)酵過程中黃曲霉減少情況
[0101]
[0102] 使用霉變的淀粉原料，制備培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。檢測發(fā)酵起始時(shí)黃曲霉素 BI含量大 約為lOmg/L。將上述六株菌進(jìn)行乙醇發(fā)酵。96小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，各菌株乙醇產(chǎn)量基本相同。 陽103] 檢測發(fā)酵前后黃曲霉素 Bl含量。如表3所示，對照菌株組黃曲霉素僅降低6%，原 因可能是菌體的物理吸附作用和自發(fā)降解。帶有黃曲霉素解毒酶基因的酵母菌體，黃曲霉 素減少幅度都高于對照菌株，說明菌體中的黃曲霉素解毒酶發(fā)揮了解毒作用。 陽104] 實(shí)施例6
[0105] 發(fā)酵結(jié)束后殘余菌體的黃曲霉素解毒酶酶活
[0106] 取實(shí)施例5中使用W霉變原料進(jìn)行發(fā)酵，獲得的酵母濕菌體IOmg,重懸于800 y L PBS緩沖液。取200 y L黃曲霉素 BUSOOppm)反應(yīng)。 陽107] 空白對照組為800 y L PBS緩沖液。取200 y L黃曲霉素 BUSOOppm)反應(yīng)。
[0108] 各處理在35度反應(yīng)化后，測定黃曲霉素濃度。
[0109] 表4轉(zhuǎn)化子和對照菌株處理黃曲霉素的效果 陽110]
陽111] 從表4可見，各菌株處理后，黃曲霉素都有所減少。但對照菌株減少幅度最小，可 能僅為物理吸附。帶有黃曲霉素解毒酶基因的酵母菌體處理黃曲霉素時(shí)，黃曲霉素減少幅 度都高于對照菌株。說明菌體中的黃曲霉素解毒酶發(fā)揮了作用。 陽11引實(shí)施例7
[0113] 構(gòu)建來源于Acinetobacter sp SM04的玉米締酬解毒酶的酵母菌株
[0114] 根據(jù)報(bào)道的來源于Acinetobacter SP SM04玉米締酬解毒酶序列 (Microbiological Research 168(2013)6 - 11)，W全基因合成的方法，獲得合成編碼玉米 締酬解毒酶的完整 ORF 序列（Microbiological Research 168(2013)6 - 11 中圖 2)。
[0115] W Gibson assembly法，將玉米締酬降解基因連入pCpAl/G-XI載體值iao et al. BMC Biotechnology 2013, 13:110)并替代pCpAl/G-XI載體中的XI基因，獲得的質(zhì)粒命 名為pCpAl-XTl。經(jīng)測序確定序列無誤。玉米締酬解毒酶基因位于TPIl啟動子和CYCl終 止子之間。
[0116] 將pCpAl-XTl轉(zhuǎn)入釀酒酵母CCTCC M94055(CCTCC即為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、， Qiina Center for Type QiltureCollection),從而獲得幾十株帶有來源于Acinetobacter SP SM04的玉米締酬解毒酶的酵母菌株轉(zhuǎn)化子。
[0117] 獲得的轉(zhuǎn)化子中，TPIl啟動子-玉米締酬解毒酶基因-CYCl終止子運(yùn)一單元，整 體插入染色體的ARGl位點(diǎn)。TPIl啟動子可W啟動玉米締酬解毒酶的組成型表達(dá)。對于轉(zhuǎn) 化子菌落經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證的、帶有玉米締酬解毒酶基因的五個轉(zhuǎn)化子，分別命名為XT11、 XT12、XT13、XT14、XT15。 陽11引 實(shí)施例8 陽119] 帶有Acinetobacter SP SM04的玉米締酬解毒酶活性的酵母發(fā)酵糧食為乙醇 [0120]采用實(shí)施例7構(gòu)建的乂1'11^1'12^1'13^1'14^1'15和對照菌株(：口'〇：194055，進(jìn) 行乙醇發(fā)酵。 陽121] W未檢出玉米締酬的原料制作培養(yǎng)基，按照文獻(xiàn)（玉米生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研 究，食品與發(fā)酵工業(yè)，2008年02期）制作培養(yǎng)基并進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)乙醇的搖瓶試驗(yàn)。在發(fā)酵開 始前，向培養(yǎng)基中添加 lOmg/L玉米締酬。 陽122] 96小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，各菌株乙醇產(chǎn)量基本相同。
[0123] 檢測發(fā)酵前后玉米締酬Bl含量。如表5示，對照菌株組玉米締酬僅降低7. 9%，原 因可能是菌體的物理吸附作用和自發(fā)降解。帶有玉米締酬解毒酶基因的酵母菌體，玉米締 酬減少幅度都高于對照菌株，說明菌體中的玉米締酬解毒酶發(fā)揮了解毒作用。
[0124] 表5轉(zhuǎn)化子和對照菌株進(jìn)行乙醇發(fā)酵中玉米締酬減少情況 陽1巧]
陽126] 實(shí)施例9 陽127] 發(fā)酵結(jié)束后殘余菌體的玉米締酬解毒酶酶活
[0128] 取實(shí)施例8獲得的酵母濕菌體IOmg,重懸于800 y L PBS緩沖液。取200 y L玉米 締酬BUSOOppm)反應(yīng)。
[0129] 空白對照組為800 y L PBS緩沖液。取200 y L玉米締酬BlPBS溶液（lOOug/mL) 反應(yīng)。
[0130] 各處理在35度反應(yīng)化后，測定玉米締酬濃度。 陽131] 表6轉(zhuǎn)化子和對照菌株處理玉米締酬的減少效果 陽m]
[0133] 從表6可見，各菌株處理后，玉米締酬都有所減少。但對照菌株減少幅度最小，可 能僅為物理吸附。帶有玉米締酬解毒酶基因的酵母菌體處理玉米締酬時(shí)，玉米締酬減少幅 度都高于對照菌株。說明菌體中的玉米締酬解毒酶發(fā)揮了作用。 陽134] 實(shí)施例10
[0135] 構(gòu)建表達(dá)Acinetobacter SP SM04黃曲霉素解毒酶基因或化niophora sp.的黃 曲霉素解毒酶產(chǎn)下二酸的重組酵母 陽136] 班巧酸表達(dá)質(zhì)粒由6個基因插入大腸-酵母穿梭質(zhì)粒pRS416構(gòu)建而成，每個基因 包含一個獨(dú)立的啟動子和終止子。運(yùn)6個基因分別如下：
[0137] 1. PCk基因編碼憐酸締醇式丙酬酸簇化酶巧C 4. 1. 1. 49)來源于班巧酸放線菌 (釀酒酵母密碼子優(yōu)化）；
[0138] 2.化d基因編碼延胡索酸還原酶巧C 1. 3. 1. 6)來源于布氏錐蟲（釀酒酵母密碼子 優(yōu)化）；
[0139] 3.化皿基因編碼延胡索酸酶巧C 4. 2. 1. 2)來源于稻根霉菌（釀酒酵母密碼子優(yōu) 化）；
[0140] 4.111化3基因編碼蘋果酸脫氨酶巧C 1. 1. 1. 37)來源于釀酒酵母； 陽141] 5. mael基因編碼蘋果酸通透酶巧C 1. 1. 1. 38)來源于粟酒裂殖酵母；