Nk細(xì)胞的分選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種M細(xì)胞的分選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫 瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā) 生。NK細(xì)胞主要分布于外周血中，占 PBMC(單個(gè)核細(xì)胞)5%~10%，淋己結(jié)和骨髓中也有NK 活性，但水平較外周血低。由于NK細(xì)胞的殺傷活性無(wú) MH邱良制，不依賴(lài)抗體，因此稱(chēng)為自然殺 傷活性。NK細(xì)胞作用于祀細(xì)胞后殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1小時(shí)、體內(nèi)4小時(shí)即可見(jiàn)到殺傷效 應(yīng)。NK細(xì)胞的祀細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞(包括部分細(xì)胞系）、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織 細(xì)胞(如血細(xì)胞）、寄生蟲(chóng)等，因此NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第 II型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。
[0003] NK細(xì)胞是免疫細(xì)胞中的一種，在臨床的免疫細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用，然而從血 液中分離的淋己細(xì)胞中的NK細(xì)胞含量很低，只有10%左右，即便常規(guī)的NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，其 濃度也僅維持在30 %~40 %左右，所W在免疫細(xì)胞治療中不能發(fā)揮NK細(xì)胞很好的光譜殺瘤 特點(diǎn)。
[0004] 細(xì)胞分選是一種很好的解決NK細(xì)胞純度不高問(wèn)題的一種方法。細(xì)胞分選是把一種 細(xì)胞從多細(xì)胞群樣品中分離出來(lái)的一種方法，通常采用抗體標(biāo)記細(xì)胞，同時(shí)抗體被巧光標(biāo) 記或連接免疫磁珠，利用巧光和免疫磁珠的特性來(lái)分離細(xì)胞。一般分正選和負(fù)選，正選是標(biāo) 記需要得到的細(xì)胞，直接分選需要的細(xì)胞，負(fù)選是標(biāo)記不需要的細(xì)胞，分選出不要的細(xì)胞， 從而得到需要的細(xì)胞。
[0005] 現(xiàn)有多種細(xì)胞分選試劑盒可適用于NK細(xì)胞的分選，現(xiàn)有較優(yōu)的細(xì)胞分選方法如 下：
[0006] 1.樣品放入。將包含有目標(biāo)細(xì)胞、標(biāo)記磁珠和雜散細(xì)胞的渾濁液放入樣杯中，樣杯 遠(yuǎn)離磁場(chǎng)；
[0007] 2.攬拌混勻:拌頭向下插入樣杯，緩慢加速旋轉(zhuǎn)，使磁珠與目標(biāo)細(xì)胞充分結(jié)合；
[000引3.靜置分選。停止攬拌，將樣杯放置于分選設(shè)備磁場(chǎng)的磁鐵上方，調(diào)節(jié)樣杯與磁鐵 的距離，采用磁力計(jì)監(jiān)測(cè)樣杯底部磁場(chǎng)強(qiáng)度，調(diào)節(jié)適合高度，靜置5-15分鐘，移除上清液，得 到分選細(xì)胞。
[0009] 然而上述分選技術(shù)中，磁珠的加入，特別是攬拌、離屯、等過(guò)程中伴隨著對(duì)細(xì)胞較大 的機(jī)械損傷，分選后得到的目標(biāo)細(xì)胞活率偏低W及細(xì)胞活性明顯降低，對(duì)分選細(xì)胞的直接 應(yīng)用或后續(xù)培養(yǎng)造成很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種NK細(xì)胞的分選 方法。本發(fā)明所述分選方法通過(guò)添加血小板提取物、乙硫醇憐酸醋，對(duì)磁珠、攬拌等外界的 損傷作用能起到很好的緩沖保護(hù)作用，同時(shí)不會(huì)影響細(xì)胞的分選效率W及NK細(xì)胞分選后的 培養(yǎng)。
[0011 ]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0012] 一種NK細(xì)胞的分選方法，包括
[0013] 步驟1、取單個(gè)核細(xì)胞加入血小板提取物和乙硫醇憐酸醋，然后加入磁珠液混勻后 解育；
[0014] 步驟2、取解育后的混合液加入血小板提取物，放入磁珠對(duì)應(yīng)磁極中進(jìn)行分選，靜 置后收集上清液。
[0015] 乙硫醇憐酸醋又名氨憐汀，氨憐汀屬注射劑，可作為腫瘤放療或細(xì)胞毒性化療的 輔助治療劑，主要用于各種癌癥的輔助治療。在對(duì)肺癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、骨腫瘤、消 化道腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤等多種癌癥患者進(jìn)行化療前應(yīng)用乙硫醇憐酸醋，可明顯減輕化療 藥物所產(chǎn)生的腎臟、骨髓、屯、臟、耳及神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。
[0016] 本發(fā)明所述分選方法通過(guò)添加血小板提取物和乙硫醇憐酸醋，對(duì)磁珠、攬拌等外 界的損傷作用能起到很好的緩沖保護(hù)作用。
[0017] 其中，在一些實(shí)施方案中，步驟1所述血小板提取物的加入量為按每1 X IO6單個(gè)核 細(xì)胞量加入0. 〇2mkO. ImL血小板提取物。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述乙硫醇憐酸醋的加入量為按每1 X IO6單個(gè)核細(xì)胞量加入 0.02mk0.05mL的乙硫醇憐酸醋。
[0019]本發(fā)明所述分選方法步驟1所述解育時(shí)間優(yōu)選為5min-10min。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，步驟2所述血小板提取物與解育后的混合液的體積比為1:2-1:3。即步驟2所述血小板提取物的加入量為解育后的混合液的體積的1/3~1/2。
[0021] 本發(fā)明所述分選方法步驟2所述靜置時(shí)間優(yōu)選為5min-15min。
[0022] 本發(fā)明所述分選方法中所述單個(gè)核細(xì)胞可W由外周血或廝帶血分離得到。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為外周血或廝帶血加入生理鹽水 稀釋?zhuān)徛尤氲胶芗杭?xì)胞分離液的離屯、管中，使稀釋的血液與淋己細(xì)胞分離液分層清 晰，400-700g離屯、15-30min，收集中間白膜層細(xì)胞。
[0024] 優(yōu)選的，所述生理鹽水與外周血或廝帶血的體積比為1:1。
[0025] 優(yōu)選的，所述淋己細(xì)胞分離液與生理鹽水稀釋的血液的體積比為1:2。
[0026] 本發(fā)明所述分選方法中所述乙硫醇憐酸醋可W通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)得到。
[0027] 本發(fā)明所述分選方法中所述血小板提取物可W由通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)的血小板提 取獲得。
[00%]在一些實(shí)施方案中，所述血小板提取物的制備方法為抑7.2的憐酸鹽緩沖液重懸 血小板后，-80°C/37°C反復(fù)凍融5次W上，然后4°C下SOOOg離屯、30minW去除血小板膜和其 他細(xì)胞殘片，收集上清液。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，所述血小板可W從外周血或廝帶血中分離得到。所述血小板 的制備方法具體為外周血或廝帶血加入生理鹽水稀釋?zhuān)徛尤氲胶芗杭?xì)胞分離液的離 屯、管中，使稀釋的血液與淋己細(xì)胞分離液分層清晰，400-700g離屯、15-30min，收集上層血 漿，200-400g離屯、5min，取上清1200-1500g離屯、，收集下層富集的血小板。
[0030] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分選方法還包括分選后的培養(yǎng)步驟。
[0031 ]本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)具體為分選得到的NK細(xì)胞接種X-VI VOl 5無(wú)血清培養(yǎng)基， 并添加0KT-3、比-2、比-15、比-21和滅活過(guò)濾血漿培養(yǎng)NKT細(xì)胞。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，所述分選后的培養(yǎng)中所述分選得到的NK細(xì)胞接種X-VIV015無(wú) 血清培養(yǎng)基的接種量為1 X 106/mL-2 X 106/血。
[0033] 本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)加入了 一些細(xì)胞因子，包括0KT-3、比-2、比-15、比-21。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)中所述0KT-3的終濃度為lOOU/mk lOOOU/mL、比-2 的終濃度為 lOOU/mklOOOU/mL、比-15 的終濃度為 lOOU/mklOOOU/mL、比-21 的終濃度為lOO-lOOOU/mL。
[0035] 本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)中還添加了滅活過(guò)濾血漿。
[0036] 所述滅活過(guò)濾血漿可W通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)或從外周血或廝帶血中分離得到。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，所述滅活過(guò)濾血漿的制備方法為外周血或廝帶血加入生理鹽 水稀釋?zhuān)徛尤氲胶芗杭?xì)胞分離液的離屯、管中，使稀釋的血液與淋己細(xì)胞分離液分層 清晰，400-700g離屯、15-30min，收集上層血漿，56 °C滅活后經(jīng)0.22皿濾器過(guò)濾。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)中所述滅活過(guò)濾血漿的添加量為 5v/v% D
[0039] 本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為14天W上。
[0040] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分選后的培養(yǎng)的每隔2-3天補(bǔ)液一次。 [00川其中，每次補(bǔ)液細(xì)胞密度為0.5 X 10*Vmk2 X lOVmL，并添加0KT-3、化-2、化-15、 比-21和滅活過(guò)濾血漿。
[0042] 優(yōu)選的，每次補(bǔ)液0訂-3的終濃度為1001]/11〇^-10001]/111^比-2的終濃度為1001]/血-1 OOOU/mL、化-15 的終濃度為 1 OOU/mL-1 OOOU/mL、化-21 的終濃度為 1 OOU/mL-1 OOOU/mL、滅活 過(guò)濾血漿的終濃度為5v/v%。
[0043] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種NK細(xì)胞的分選方法，取單個(gè)核細(xì)胞加入 血小板提取物和乙硫醇憐酸醋，然后加入磁珠液混勻后解育；取解育后的混合液加入血小 板提取物，放入磁珠對(duì)應(yīng)磁極中進(jìn)行分選，靜置后收集上清液。本發(fā)明所述分選方法通過(guò)添 加血小板提取物、乙硫醇憐酸醋，對(duì)磁珠、攬拌等外界的損傷作用能起到很好的緩沖保護(hù)作 用，同時(shí)不會(huì)影響細(xì)胞的分選效率W及NK細(xì)胞分選后的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用本發(fā)明所 述NK細(xì)胞的分選方法得到的NK細(xì)胞，細(xì)胞活率高、增殖速度快，可W獲得更高純度的NK細(xì) 胞，得到的NK細(xì)胞殺傷效果也明顯高于常規(guī)的分選方法分選得到NK細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0045] 圖1示試驗(yàn)例2各組增殖曲線；其中、、、、唯、、*示對(duì)比例1分選得到NK細(xì)胞、心藝心示實(shí) 施例3分選得到NK細(xì)胞、示實(shí)施例4分選得到NK細(xì)胞、.'、、、、、H、、、、、實(shí)施例5分選得到NK細(xì)胞；
[0046] 圖2示試驗(yàn)例2中對(duì)比例1分選得到NK細(xì)胞培養(yǎng)14天后細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3+CD56+表 達(dá)情況圖；
[0047] 圖3示試驗(yàn)例2中實(shí)施例5分選得到NK細(xì)胞培養(yǎng)14天后細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3+CD56