由同二聚重鏈(AA)組 成的五聚IgM產(chǎn)生大致1，000,000分子量的蛋白質(zhì)條帶。由較短型式的同二聚重鏈(BB)組成 的五聚IgM產(chǎn)生顯著較低分子量的蛋白質(zhì)條帶。由異二聚重鏈(嵌合AB)組成的五聚IgM產(chǎn)生 具有大于BB并且小于AA的分子量的多種蛋白質(zhì)。
[0338] 在裝載到凝膠上之前，在25C下將Nu化ge LDS樣本緩沖液化ife Technologies)添 加至IjIgM蛋白樣本中持續(xù)30分鐘。NativePage Novex 3-12%Bis-T;ris凝膠化ife Technologies)與Novex Tris-乙酸鹽SDS運(yùn)行緩沖液(Xife Technologies)-起使用。進(jìn)行 跑膠，直到前側(cè)染料到達(dá)凝膠底部。
[0339] ?還原 SDS-PAGE
[0340] 將Nu化ge LDS樣本緩沖液化ife Technologies)和Nu化ge還原劑二硫蘇糖醇 (Life Technologies)添加到IgM蛋白樣本中并且在裝載于N證age Novex 4-12%813-化13 凝膠化ife Technologies,目錄號(hào)NP0322)上之前加熱到80°C持續(xù)10分鐘。N證age MES SDS 運(yùn)行緩沖液化ife Technologies,目錄號(hào)NP0002)用于凝膠電泳。進(jìn)行跑膠，直到前側(cè)染料 到達(dá)凝膠底部。
[0%1]在電泳完成之后，從設(shè)備除去凝膠并且使用膠體藍(lán)染色化ife Technologies,手 冊(cè)化C6025)將凝膠染色
[0342] ?凝膠條帶定量
[0343] 將蛋白質(zhì)凝膠干燥，然后使用圖像掃描儀進(jìn)行數(shù)字化。將凝膠圖像用圖像J程序處 理，并且特定條帶中蛋白質(zhì)的量可使用凝膠定量功能來確定
[0344] iv.質(zhì)譜分析，W鑒別/定量雙特異性制劑中的各種mAb。
[0345] V.使用差示掃描量熱法(DSC)的穩(wěn)定性分析 [03W e.雙特異性功能分析
[0：347] i .兩種配體的ELISA分析
[0348] 通過化ISA分析利用可溶性CD3e蛋白捕集和抗CMy C (犯10)檢測來測定具有0KT3 (鏈A)和cMyC膚(鏈B)的IgM。將可溶性CD3e蛋白W2mg/ml于150mM Na肥〇3中涂布在ELISA板 上，接著用3%BSA的PBS溶液阻斷。在25C下將含有轉(zhuǎn)染IgM-0KT3-cMyc的上清液（IOOiil)添 加到阻斷ELISA板持續(xù)4小時(shí)。在用PBS洗涂之后，在室溫下將9E10抗體添加至化LISA板持續(xù)2 小時(shí)。在用PBS洗涂之后，添加抗小鼠 IgG-皿P。在添加皿P底物之后通過在OD 450的情況下 讀取來檢測雙特異性IgM的存在。
[0349] i i .祀標(biāo)結(jié)合的FACS分析
[0350] 通過將抗體結(jié)合至T細(xì)胞系（Peer,陽性細(xì)胞系）和B細(xì)胞系(Daudi，陰性對(duì)照細(xì)胞 系)來確認(rèn)IgM-0KT3-cMyc結(jié)合至T細(xì)胞。在洗涂之后，將羅丹明標(biāo)記的犯10添加到細(xì)胞懸浮 液中。通過具有或不具有CD20抗原的陽性和陰性對(duì)照細(xì)胞的MFI來檢測細(xì)胞祀標(biāo)結(jié)合。
[0351] iii.雙特異性結(jié)合的巧光顯微術(shù)測定
[0352] 通過所設(shè)計(jì)IgM使兩個(gè)群體CD3陽性細(xì)胞和CD20陽性細(xì)胞結(jié)合在一起的能力驗(yàn)證 其雙特異性結(jié)合，所述細(xì)胞通過在各細(xì)胞型上的兩種不同活體染料進(jìn)行預(yù)標(biāo)記。例如：
[0353] ?綠色巧光胞質(zhì)液活體染料(CellTrace?巧黃綠素綠AM)，其標(biāo)記CD3陽性細(xì)胞系 (Peer)
[0354] ?紅色巧光胞質(zhì)液活體染料(CellTrace?巧黃綠素紅色-澄色，AM)，其標(biāo)記CD20陽 性B細(xì)胞系（Daudi)
[0355] 可使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(諸如上文描述的那些技術(shù)），W相似的方式進(jìn)行多特 異性結(jié)合和多特異性功能分析。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，其包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元，其 中所述雙特異性結(jié)合單元各自具有相同的兩種結(jié)合特異性并且包含第一鏈和第二鏈，所述 第一鏈至少包含與第一結(jié)合靶標(biāo)的第一結(jié)合區(qū)綴合的IgM重鏈恒定區(qū)的Cy4域，所述第二鏈 至少包含IgM重鏈恒定區(qū)的Cy4域和第二結(jié)合靶標(biāo)的第二結(jié)合區(qū)，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和 所述第二結(jié)合靶標(biāo)不同，并且其中所述第一鏈和所述第二鏈經(jīng)過組裝以由于它們個(gè)別IgM 重鏈恒定區(qū)之間所產(chǎn)生的不對(duì)稱界面而產(chǎn)生雙特異性結(jié)合單元。2. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中所述雙特異性結(jié)合單元是相同的。3. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子還包含IgM J鏈。4. 如權(quán)利要求3所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)。5. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子具有六聚結(jié)構(gòu)。6. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其中所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重鏈恒定區(qū) 的Cy3域。7. 如權(quán)利要求2或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重鏈恒 定區(qū)的Cy2域。8. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)選自肽、 多肽、糖蛋白、核酸分子以及有機(jī)小分子和非有機(jī)小分子。9. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)選自可 溶性多肽、細(xì)胞表面受體、配體、分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶和酶底物。10. 如權(quán)利要求2所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)結(jié)合至 相同可溶性靶標(biāo)上的兩個(gè)位點(diǎn)、相同細(xì)胞表面受體靶標(biāo)上的兩個(gè)位點(diǎn)、兩個(gè)不同可溶性靶 標(biāo)、兩個(gè)細(xì)胞表面受體靶標(biāo)、一個(gè)可溶性靶標(biāo)和一個(gè)細(xì)胞表面受體靶標(biāo)、一個(gè)可溶性靶標(biāo)或 細(xì)胞表面受體靶標(biāo)和一個(gè)長停留時(shí)間靶標(biāo)、一個(gè)可溶性靶標(biāo)和一個(gè)基質(zhì)蛋白靶標(biāo)或底物靶 標(biāo)、一個(gè)可溶性靶標(biāo)或受體靶標(biāo)和一個(gè)分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白靶標(biāo)，或兩個(gè)不同細(xì)胞類型。11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中綴合是通過融合。12. 如權(quán)利要求11所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)分別融合 至所述第一 IgM重鏈恒定區(qū)和所述第二IgM重鏈恒定區(qū)的N末端。13. 如權(quán)利要求12所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)是抗體的 可變區(qū)。14. 如權(quán)利要求13所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)是兩 個(gè)不同抗原。15. 如權(quán)利要求13所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)是相 同抗原上的不同表位。16. 如權(quán)利要求13所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)分別是結(jié) 合至所述第一結(jié)合靶標(biāo)和所述第二結(jié)合靶標(biāo)的兩個(gè)不同抗體重鏈可變區(qū)。17. 如權(quán)利要求13所述的結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合區(qū)和所述第二結(jié)合區(qū)是各自結(jié) 合至相同結(jié)合靶標(biāo)上不同表位的兩個(gè)不同抗體重鏈可變區(qū)。18. 如權(quán)利要求16或17所述的結(jié)合分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)來自IgG、IgA、IgE或 IgM抗體。19. 如權(quán)利要求18所述的結(jié)合分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)來自IgM抗體。20. 如權(quán)利要求16或17所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子是雙特異性IgM分子。21. 如權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其還包含與所述兩個(gè)不同IgM重鏈可變區(qū)中的至少 一個(gè)締合的至少一個(gè)IgM輕鏈可變區(qū)序列。22. 如權(quán)利要求20所述的結(jié)合分子，其還包含與所述兩個(gè)不同IgM重鏈可變區(qū)中的每一 個(gè)締合的IgM輕鏈可變區(qū)序列。23. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中在結(jié)合單元的所述兩條鏈的所述 IgM重鏈恒定區(qū)之間，至少一些所述不對(duì)稱界面由鹽橋產(chǎn)生，所述鹽橋由所述結(jié)合單元的所 述兩條鏈的所述&2Χμ3和/或Cy4域中的至少一個(gè)中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對(duì) 開關(guān)形成。24. 如權(quán)利要求23所述的結(jié)合分子，其中鹽橋在所述結(jié)合單元的所述兩條鏈的所述Cy 2-Cy2、Cy4-Cy4和Cy2-Cy3-Cy4域中的至少一個(gè)之間形成。25. 如權(quán)利要求23所述的結(jié)合分子，其中所述成對(duì)開關(guān)選自由以下組成的組:Ε-Κ、Κ- Ε; R-E、E-R; D-K、K-D;和 R-D、D-R。26. 如權(quán)利要求24所述的結(jié)合分子，其包含所述Cy4-Cy4域中至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨 基酸殘基開關(guān)。27. 如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由以下組成的組： R328E"D^E339R,K ； R344E,D<->S330R,K；K376E,D^E.385R.K ； R427E,DeE339R，K;和 T354E,D^1397R,K!：28. 如權(quán)利要求24所述的結(jié)合分子，其包含所述Cy2-Cy2域之間的至少一個(gè)帶成對(duì)電荷 的氨基酸開關(guān)。29. 如權(quán)利要求2 8所述的結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由El67R,KeKl77E,D和 K丨69E,DeE 170丨UC組成的組。30. 如權(quán)利要求24所述的結(jié)合分子，其包含所述Cy2-Cy3-Cy4域中至少一個(gè)帶成對(duì)電荷 的氨基酸殘基開關(guān)。31. 如權(quán)利要求29所述的結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由以下組成的組： ΟΠΙΚ,Κ^ΙΟΙ^Ο,Ε； K150E,D^E385K,R；iPKlg5D,E^D360K,R〇32. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中在結(jié)合單元的所述兩條鏈的所述 IgM重鏈恒定區(qū)之間，至少一些所述不對(duì)稱界面通過鈕-孔連接來產(chǎn)生。33. 如權(quán)利要求32所述的結(jié)合分子，其中至少一個(gè)鈕-孔連接由選自由以下組成的組的 突變產(chǎn)生：鈕:T350-Y，F(xiàn)，W;和 H395-Y，F(xiàn);和孔:L3524G，A，V，I，M，S，T;H395-A，V，I，L，M， F，Y;F3934W，Y;I397-A，V，S，T;T35〇4S，A，V ;和 T348-S。34. 如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其中所述輕鏈可變區(qū)序列通過在所 述輕鏈與所述重鏈之間產(chǎn)生不對(duì)稱界面來偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。35. 如權(quán)利要求34所述的結(jié)合分子，其中所述不對(duì)稱界面通過CrossMab技術(shù)、鈕-孔偶 聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來產(chǎn)生。36. 如權(quán)利要求21至35中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其包含共同輕鏈。37. 如權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其綴合至毒素。38. 如權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其綴合至化療劑。39. 如權(quán)利要求37或38所述的結(jié)合分子，其中綴合是通過融合。40. 如權(quán)利要求37或38所述的結(jié)合分子，其中綴合是通過化學(xué)連接子。41. 如權(quán)利要求20至40中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子，其是嵌合的或人源化的。42. -種組合物，其包含至少約70 %根據(jù)1至41中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。43. -種組合物，其包含至少約80 %根據(jù)1至41中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。44. 一種組合物，其包含至少約95 %根據(jù)權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。45. -種組合物，其包含至少約98 %根據(jù)權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。46. -種組合物，其包含至少約99%根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。47. 如權(quán)利要求42至46中任一項(xiàng)所述的組合物，其是藥物組合物。48. -種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的多特異性結(jié)合分子，其包含五個(gè)或六個(gè)單特異性結(jié) 合單元，其中（i)所述單特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，其各自至少包含綴 合至結(jié)合革E標(biāo)的結(jié)合區(qū)的Cy3和Cy4域，（ii)至少兩個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié) 合靶標(biāo)，并且（iii)外部不對(duì)稱界面在結(jié)合至不同靶標(biāo)的所述鄰近單特異性結(jié)合單元的所 述重鏈恒定區(qū)之間產(chǎn)生。49. 如權(quán)利要求48所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少三個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié) 合至不同結(jié)合靶標(biāo)。50. 如權(quán)利要求48所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少四個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié) 合至不同結(jié)合靶標(biāo)。51. 如權(quán)利要求48所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且 所有五個(gè)單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同靶標(biāo)。52. 如權(quán)利要求48所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有六聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且 至少五個(gè)所述單特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同祀標(biāo)。53. 如權(quán)利要求52所述的多特異性結(jié)合分子，其中所有六個(gè)單特異性結(jié)合單元結(jié)合至 不同靶標(biāo)。54. -種具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的多特異性結(jié)合分子，其包含五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié) 合單元，其中（i)所述雙特異性結(jié)合單元各自包含兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)，其各自至少包含綴 合至結(jié)合靶標(biāo)的結(jié)合區(qū)的Cy3和Cy4域，（ii)至少兩個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同結(jié) 合靶標(biāo)，（iii)內(nèi)部不對(duì)稱界面在各雙特異性結(jié)合單元的兩個(gè)IgM重鏈恒定區(qū)之間產(chǎn)生，并 且（iv)外部不對(duì)稱界面在結(jié)合至不同靶標(biāo)的所述鄰近雙特異性結(jié)合單元的所述重鏈恒定 區(qū)之間產(chǎn)生。55. 如權(quán)利要求54所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少三個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié) 合至不同結(jié)合靶標(biāo)。56. 如權(quán)利要求54所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少四個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié) 合至不同結(jié)合靶標(biāo)。57. 如權(quán)利要求54所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且 所有五個(gè)雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同靶標(biāo)。58. 如權(quán)利要求54所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有六聚環(huán)結(jié)構(gòu)并且 至少五個(gè)所述雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至不同祀標(biāo)。59. 如權(quán)利要求52所述的多特異性結(jié)合分子，其中所有六個(gè)雙特異性結(jié)合單元結(jié)合至 不同結(jié)合靶標(biāo)。60. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其還包含IgM J鏈。61. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其具有五聚環(huán)結(jié)構(gòu)。62. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其具有六聚結(jié)構(gòu)。63. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其中在至少一個(gè)所述結(jié)合單元中，所 述IgM重鏈恒定區(qū)還包含Cy2域。64. 如權(quán)利要求63所述的多特異性結(jié)合分子，其中在所有所述結(jié)合單元中，所述IgM重 鏈恒定區(qū)還包含Cy2域。65. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其中在所有所述結(jié)合單元中，所述重 鏈恒定區(qū)是相同的。66. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合祀標(biāo)選自肽、多肽、糖 蛋白、核酸分子以及有機(jī)小分子和非有機(jī)小分子。67. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合靶標(biāo)選自可溶性多肽、 細(xì)胞表面受體、配體、分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶和酶底物。68. 如權(quán)利要求48或54所述的多特異性結(jié)合分子，其中結(jié)合至不同靶標(biāo)的所述結(jié)合單 元選自由結(jié)合至以下的結(jié)合單元組成的組:相同可溶性靶標(biāo)上的位點(diǎn)；相同細(xì)胞表面受體 靶標(biāo)上的位點(diǎn)；不同可溶性靶標(biāo);不同細(xì)胞表面受體靶標(biāo);可溶性靶標(biāo)和細(xì)胞表面受體靶 標(biāo);可溶性靶標(biāo)或細(xì)胞表面受體靶標(biāo)和長停留時(shí)間靶標(biāo);可溶性靶標(biāo)和基質(zhì)蛋白靶標(biāo)或底 物靶標(biāo);可溶性靶標(biāo)或受體靶標(biāo)和分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白靶標(biāo)，和不同細(xì)胞類型。69. 如權(quán)利要求48至68中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其中綴合是通過融合。70. 如權(quán)利要求67所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述結(jié)合區(qū)融合至所述IgM重鏈恒定 區(qū)的N末端。71. 如權(quán)利要求70所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少一個(gè)所述結(jié)合區(qū)是抗體的可變 區(qū)。72. 如權(quán)利要求71所述的多特異性結(jié)合分子，其中所有所述結(jié)合區(qū)是抗體重鏈可變區(qū)。73. 如權(quán)利要求72所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少兩個(gè)結(jié)合靶標(biāo)是不同抗原。74. 如權(quán)利要求72所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少兩個(gè)結(jié)合靶標(biāo)是相同抗原上的 不同表位。75. 如權(quán)利要求71所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)來自IgG、IgA、 I gE或IgM抗體。76. 如權(quán)利要求75所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)來自IgM抗體。77. 如權(quán)利要求76所述的多特異性結(jié)合分子，其是多特異性IgM分子。78. 如權(quán)利要求77所述的多特異性結(jié)合分子，其還包含與至少一個(gè)所述結(jié)合單元中的 IgM重鏈可變區(qū)締合的至少一個(gè)IgM輕鏈可變區(qū)序列。79. 如權(quán)利要求78所述的多特異性結(jié)合分子，其還包含與所述IgM重鏈可變區(qū)中的每一 個(gè)締合的IgM輕鏈可變區(qū)序列。80. 如權(quán)利要求48至79中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述內(nèi)部不對(duì)稱界面 通過由所述Cy2、Cy3和/或Cy4域中的至少一個(gè)中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對(duì)開關(guān) 所形成的鹽橋來產(chǎn)生。81. 如權(quán)利要求80所述的多特異性結(jié)合分子，其中鹽橋在所述結(jié)合單元的所述兩條鏈 的所述Cy2-Cy2、Cy4-Cy4和Cy2-Cy3-Cy4域中的至少一個(gè)之間形成。82. 如權(quán)利要求81所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述成對(duì)開關(guān)選自由以下組成的組： E-K、K-E; R-E、E-R; D-K、K-D;和 R-D、D-R。83. 如權(quán)利要求80所述的多特異性結(jié)合分子，其包含所述Cy4-Cy4域中的至少一個(gè)帶成 對(duì)電荷的氨基酸殘基開關(guān)。84. 如權(quán)利要求83所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由以下組成的組： R328E，DhE339R，I< ; R344E，D<-S330R，I(;丨(376E，DeE385R，K |R427E，DhE339R，K; fllT354E,D^I397R,K,85. 如權(quán)利要求80所述的多特異性結(jié)合分子，其包含所述Cy2-Cy2域之間的至少一個(gè)帶 成對(duì)電荷的氨基酸開關(guān)。86. 如權(quán)利要求85所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由E167R,KeK177E,D 和丨（169E J)eE丨70R，K組成的組。87. 如權(quán)利要求80所述的多特異性結(jié)合分子，其包含所述Cy2-Cy3-Cy4域中的至少一個(gè) 帶成對(duì)電荷的氨基酸殘基開關(guān)。88. 如權(quán)利要求87所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述開關(guān)選自由以下組成的組： D121 !〈，ReK315D,E; K1 50E,DhE385K,R;和K1 85Ο,Εη〇360Κ,Ι^89. 如權(quán)利要求48至88中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述外部不對(duì)稱界面 通過所述Cy3-Cy3域中的至少一個(gè)帶成對(duì)電荷的氨基酸殘基開關(guān)產(chǎn)生。90. 如權(quán)利要求89所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述帶成對(duì)電荷的氨基酸開關(guān)是 K238 η D2()3或丨(268 b91. 如權(quán)利要求48至79中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述IgM重鏈恒定區(qū)之 間的至少一些所述外部不對(duì)稱界面和/或所述內(nèi)部不對(duì)稱界面通過鈕-孔連接來產(chǎn)生。92. 如權(quán)利要求91所述的多特異性結(jié)合分子，其中至少一個(gè)鈕-孔連接由選自由以下組 成的組的突變產(chǎn)生：鈕:T350-Y，F(xiàn)，W;和 H395-Y，F(xiàn);和孔：L3524G，A，V，I，M，S，T;H395-A， V，I，L，M，F(xiàn)，Y;F3934W，Y;I397-A，V，S，T;T35〇4S，A，V ;和 T348-S。93. 如權(quán)利要求79至92中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述輕鏈可變區(qū)序列 通過在所述輕鏈與所述重鏈之間產(chǎn)生不對(duì)稱界面來偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。94. 如權(quán)利要求93所述的多特異性結(jié)合分子，其中所述不對(duì)稱界面通過CrossMab技術(shù)、 鈕-孔偶聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來產(chǎn)生。95. 如權(quán)利要求79至94中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其包含共同輕鏈。96. 如權(quán)利要求48至95中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其綴合至毒素。97. 如權(quán)利要求48至95中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其綴合至化療劑。98. 如權(quán)利要求96或97所述的多特異性結(jié)合分子，其中綴合是通過融合。99. 如權(quán)利要求96或97所述的多特異性結(jié)合分子，其中綴合是通過化學(xué)連接子。100. 如權(quán)利要求79至99中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子，其是嵌合的或人源化的。101. -種組合物，其包含至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或 至少約98%、或至少約99%根據(jù)48至100中任一項(xiàng)所述的多特異性結(jié)合分子。102. 如權(quán)利要求101所述的組合物，所述組合物是藥物組合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，諸如像具有五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元的分離的IgM抗體，以及用于制備和使用所述結(jié)合分子的方法和方式。本發(fā)明還涉及具有五聚或六聚環(huán)結(jié)構(gòu)的多特異性結(jié)合分子，諸如像具有五個(gè)或六個(gè)雙特異性結(jié)合單元的分離的IgM抗體，以及用于制備和使用所述結(jié)合分子的方法和方式。
【IPC分類】C07K16/28, C07K16/00
【公開號(hào)】CN105722855
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480051238
【發(fā)明人】B.基特, F.張, L.G.普雷斯塔, R.約希穆拉
【申請(qǐng)人】Igm生命科學(xué)股份有限公司
【公開日】2016年6月29日
【申請(qǐng)日】2014年9月4日
【公告號(hào)】CA2922830A1, EP3041862A1, WO2015053887A1