熱梯度微反應(yīng)器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于體外分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)中的熱梯度微反應(yīng)器。
【背景技術(shù)】
[0002]POCT(point of care testing) 一般稱為即時檢驗，是體外診斷(IVD)的一個細分行業(yè)，其憑借便捷、快速的優(yōu)勢，可實現(xiàn)在患者身邊快速取得診斷結(jié)果，成為近年來快速發(fā)展的一個新興領(lǐng)域。目前正在發(fā)展的POCT依據(jù)其技術(shù)特性主要劃分為三代:以快速診斷試紙(如血糖試紙條、早孕試紙條等)為基礎(chǔ)的第一代P0CT，以卡盒式核酸擴增為基礎(chǔ)的第二代P0CT，以智能手機的應(yīng)用為基礎(chǔ)的第三代P0CT。相比于前兩代P0CT，第三代POCT由于其具備高靈敏高特異的多參數(shù)定量的檢測能力和更加集成便攜、操作簡便、用戶友好等諸多潛在優(yōu)勢，已成為體外即時檢測領(lǐng)域的最前沿技術(shù)。
[0003]在第三代POCT基因分析類儀器中，普遍采用基于微流控技術(shù)的核酸擴增方法作為核心技術(shù)來實現(xiàn)具備上述特征的快速分子診斷。然而，目前發(fā)展中的這類POCT基因分析系統(tǒng)包括基于時域聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)類的系統(tǒng)和基于等溫擴增類的系統(tǒng)，由于其各自技術(shù)的固有特點，兩類技術(shù)均存在著一些制約瓶頸。時域PCR類:其實質(zhì)相當(dāng)于傳統(tǒng)熱循環(huán)儀的微型化，其熱循環(huán)需要精確重復(fù)的升或降溫而且熱元件(或結(jié)構(gòu))存在自身熱慣性，這些因素通常會導(dǎo)致大量時間和能量的消耗、溫度控制的復(fù)雜、成本的上升、熱設(shè)計上的笨重。等溫擴增類:一方面，其擴增過程無需熱循環(huán)，其檢測的靈敏度、準確性和可定量性極其依賴于擴增過程在時間上的持續(xù)，通常只能針對具體樣品的反應(yīng)體系建立與之對應(yīng)的時間持續(xù)標度，缺乏普適性，因而存在實際操作上的困難；另一方面，擴增產(chǎn)物的可靠檢測比較困難，目前其擴增產(chǎn)物主要依賴終點檢測(如電泳等)，雖然可以通過監(jiān)測擴增過程中的熒光或溶液濁度等信號的累積來進行定量檢測，但卻犧牲了其檢測的特異性，因為任何非特異性或附生型的產(chǎn)物也能累積上述檢測信號，因此這類定量檢測存在假陽性風(fēng)險。作為一種微流控核酸擴增新技術(shù)，空域PCR利用“空間交換時間”讓樣品反應(yīng)液反復(fù)通過兩或三個恒溫區(qū)來實現(xiàn)PCR所需的熱循環(huán)，消除了精確反復(fù)升降溫的需求，避免了熱系統(tǒng)自身的熱滯，在熱循環(huán)速度、系統(tǒng)能耗、溫度控制和整體尺寸等方面具有顯著優(yōu)勢，但目前基于該技術(shù)的基因分析裝置尚未達到面向POCT應(yīng)用階段，主要表現(xiàn)為:(I)集成度不足，仍然依賴笨重的離線設(shè)備和資源，如:泵源、溫度控制系統(tǒng)、計算機、臺式檢測器和電源等；(2)功能單一，大多僅具有核酸擴增功能，缺乏關(guān)鍵性的在線分析能力包括實時定量檢測和產(chǎn)物鑒別。顯然，目前已發(fā)展的第三代POCT基因分析類儀器仍存在一些不便和缺陷，亟待加以進一步發(fā)展和改進。
[0004]為此，需要發(fā)明一種手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，克服現(xiàn)有POCT基因分析儀器在分析速度、多元與定量檢測、能源消耗、便攜性和操作簡便等方面的缺陷與不足，使其秉承POCT理念，具有體積小巧便攜，操作簡便直觀，可現(xiàn)場化使用、成本低等優(yōu)點，并且具備高速高靈敏高特異性擴增、實時定量檢測、多元核酸鑒別和同時多批次樣品分析等能力，使之適用于更廣泛的應(yīng)用場合。該手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)主要包括熱梯度微反應(yīng)器、智能手機寬場熒光成像器、微流體驅(qū)動器、電子控制系統(tǒng)和充電電池組。本實用新型的熱梯度微反應(yīng)器即為其中的一部分。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本實用新型的目的是:提供一種通過單個加熱元件即可在發(fā)熱基底的外表面形成解鏈溫度區(qū)間、退火/延伸溫度區(qū)間和延伸-解鏈線性熱梯度區(qū)間，以獲得不同樣品的退火/延伸的最佳反應(yīng)溫度和合適的融解分析溫度區(qū)間，供微通道中通過的樣品反應(yīng)液進行高效PCR擴增和高分辨融解分析。
[0006]為了達到上述目的，本實用新型采用如下技術(shù)方案:
[0007]熱梯度微反應(yīng)器，包括發(fā)熱基底、微通道、加熱元件、溫度傳感器和供發(fā)熱基底散熱的散熱裝置；發(fā)熱基底包括實心柱體段和空心柱體段；空心柱體段的橫截面為開口朝向?qū)嵭闹w段的U形，實心柱體段與U形開口的一端相接且與U形開口的另一端斷開；微通道呈螺線管式纏繞在發(fā)熱基底外，螺線管的軸線與發(fā)熱基底的長度方向一致；加熱元件和溫度傳感器安裝在實心柱體段內(nèi)。此處所說的螺線管類似螺紋形狀，區(qū)別在于其纏繞的母體形狀并非螺紋的圓柱形或圓錐形，而為發(fā)熱基底的柱體形。發(fā)熱基底為導(dǎo)熱系數(shù)適中的金屬材質(zhì)或其它具有線性熱導(dǎo)率的復(fù)合導(dǎo)熱材質(zhì)。采用這種結(jié)構(gòu)后，通過單個加熱元件配合溫度傳感器、散熱裝置有效控制發(fā)熱基底的溫度，從而在發(fā)熱基底表面形成解鏈溫度區(qū)間、退火/延伸溫度區(qū)間和延伸-解鏈線性熱梯度區(qū)間，且區(qū)間的大小、位置均可靈活調(diào)整，能快速對微通道內(nèi)的反應(yīng)液樣品進行擴增，為后續(xù)熒光成像分析做準備提供高密度的通道單元和大面積的成像視野。
[0008]進一步，實心柱體段與空心柱體段相連接的部位位于發(fā)熱基底的上端，實心柱體段與空心柱體段相斷開的部位位于發(fā)熱基底的下端，實心柱體段位于發(fā)熱基底的左端，空心柱體段位于發(fā)熱基底的右端；實心柱體段的左端表面為半圓柱面，空心柱體段的右端表面也為半圓柱面，兩半圓柱面的半徑相同。采用這種結(jié)構(gòu)后，即發(fā)熱基底采用特殊的形狀，一方面便于微通道纏繞，另一方面能有效控制各區(qū)間的大小和位置。
[0009]進一步，發(fā)熱基底的外表面設(shè)有呈螺線管式分布的U形溝槽，微通道嵌入U形溝槽中。采用這種結(jié)構(gòu)后，U形溝槽將微通道環(huán)繞，加速熱量的傳遞，熱量傳遞均勻；同時微通道依預(yù)先加工好的U形溝槽布置，纏繞方便。
[0010]進一步，空心柱體段的下端具有一個凸出塊；發(fā)熱基底通過凸出塊安裝在散熱裝置上。采用這種結(jié)構(gòu)后，結(jié)構(gòu)簡單，安裝方便。
[0011]進一步，散熱裝置包括散熱片和朝向散熱片吹風(fēng)的微型渦輪風(fēng)扇；凸出塊安裝在散熱片的上端。采用這種結(jié)構(gòu)后，散熱片配合微型渦輪風(fēng)扇散熱，操作簡單，散熱可靠；調(diào)節(jié)風(fēng)扇的功率即可調(diào)整溫度區(qū)間的溫度跨度和有效長度。
[0012]進一步，凸出塊為立方體形；凸出塊與發(fā)熱基底一體成型，發(fā)熱基底在凸出塊所在區(qū)域繼續(xù)由上述U型溝槽貫穿，凸出塊的下端平面緊貼散熱片的上端。采用這種結(jié)構(gòu)后，凸出塊的上端直接覆蓋在發(fā)熱基底的下端，一體制作成型，兩者之間留有U形溝槽，安裝微通道時只需穿過U形溝槽即可。
[0013]進一步，實心柱體段的長度大于空心柱體段的長度；實心柱體段的前端與空心柱體段的前端對齊，實心柱體段的后端凸出于空心柱體段的后端。采用這種結(jié)構(gòu)后，實心柱體段凸出于空心柱體段的一段形成圓柱區(qū)，其余的發(fā)熱基底形成扁平區(qū)，即可將PCR預(yù)變性區(qū)控制在圓柱區(qū)處。
[0014]進一步，實心柱體段內(nèi)開設(shè)沿著實心柱體段的長度方向延伸的圓形通孔，實心柱體段內(nèi)還開設(shè)沿著實心柱體段的長度方向延伸的插孔；加熱元件為電加熱棒，安裝在圓形通孔內(nèi)；溫度傳感器為K型熱電偶，安裝在插孔內(nèi)。優(yōu)選的，電加熱棒位于實心柱體段的半圓柱面的中心軸線上。采用這種結(jié)構(gòu)后，結(jié)構(gòu)簡單、安裝方便，加熱元件可對發(fā)熱基底進行均勻加熱，溫度易于控制。
[0015]進一步，微通道為透明聚四氟乙烯毛細管。采用這種結(jié)構(gòu)后，便于微通道內(nèi)的反應(yīng)液進行熒光的激發(fā)與成像。
[0016]進一步，微通道呈螺線管式纏繞至實心柱體段的后端，微通道位于后端的一端為進樣口。采用這種結(jié)構(gòu)后，可將PCR預(yù)變性區(qū)控制在圓柱區(qū)處。
[0017]本發(fā)明的原理是:
[0018]微通道緊密包埋于發(fā)熱基底的U型溝槽中；通過溫度傳感器反饋控制加熱元件工作，保持單個加熱元件維持恒定溫度即可在發(fā)熱基底外表面形成解鏈溫度區(qū)間、退火/延伸溫度區(qū)間和延伸-解鏈線性熱梯度區(qū)間，且通過調(diào)節(jié)散熱裝置的輸出功率可以靈活改變上述溫度區(qū)間的溫度及區(qū)間長度，以適應(yīng)最佳擴增效果和檢測效果；微通道中的反應(yīng)液通過微流體驅(qū)動器以油相為載流體驅(qū)動其沿微通道流動，依次經(jīng)歷解鏈溫度區(qū)間、退火/延伸溫度區(qū)間和延伸-解鏈線性熱梯度區(qū)間。在延伸-解鏈溫度區(qū)之間形成空間融解分析所需的線性熱梯度區(qū)。通過調(diào)節(jié)散熱裝置的輸出功率，可實現(xiàn)對退火/延伸區(qū)間溫度跨度的改變以獲得不同引物退火/延伸的最佳反應(yīng)溫度和合適的融解分析溫度區(qū)間。優(yōu)選的，發(fā)熱基底的上表面作為熒光檢測區(qū)，其有效檢測區(qū)的位置、面積、形狀通過安裝在其近表面的智能手機寬場熒光成像器的光闌來來調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不同的檢測需求。
[0019]總的說來，本實用新型具有如下優(yōu)點:結(jié)構(gòu)緊湊、溫度控制簡單；解鏈溫度區(qū)間、退火/延伸溫度區(qū)間和延伸-解鏈線性熱梯度區(qū)間的溫度跨度、位置均可靈活調(diào)整；能快速對微通道內(nèi)的反應(yīng)液進行擴增，為后續(xù)熒光成像分析做準備。
【附圖說明】
[0020]圖1是熱梯度微反應(yīng)器的拆分圖。
[0021]圖2是發(fā)熱基底的立體圖。
[0022]圖3是發(fā)熱基底的功能分區(qū)圖。
[0023]圖4是手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)的立體圖。
[0024]圖5是16拷貝/微升的單增李斯特菌基因組DNA在手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)上擴增過程的典型熒光圖像。
[0025]圖6是圖5所示熒光圖像對應(yīng)的擴增曲線
[0026]圖7是16拷貝/微升的沙門菌基因組DNA、金葡萄球菌基因組DNA和單增李斯特菌基因組DNA在手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)上串行擴增的熒光圖像。
[0027]圖8是圖7所示熒光圖像對應(yīng)的融解曲線。
[0028]其中，I為熱梯度微反應(yīng)器，2為智能手機寬場熒光成像器，3為微流體驅(qū)動器、4為電子控制系統(tǒng)，5為充電電池組，6為含絕熱底板的避光外殼。
[0029]1-1為發(fā)熱基底，1-2為微通道，1-3為加熱元件，1_4為溫度傳感器，1_5為散熱片，1-6為微型渦輪風(fēng)扇，1-1-1為插孔，1-1-2為圓形通孔，1-1-3為斷開部，1-1-4為凸出塊，1-1-5為U形溝槽，1-1-6為圓柱區(qū)，1-1-7為扁平區(qū)，1-1-8為熒光檢測區(qū)，1-2-1為進樣口，1-2-2 為出口。
【具體實施方式】
[0030]下面將結(jié)合附圖和【具體實施方式】來對本實用新型做進一步詳細的說明。
[0031]熱梯度微反應(yīng)器，是應(yīng)如下需求而設(shè)計制造的:(I)通過維持單個加熱元件保持一定溫度來產(chǎn)生PCR熱循環(huán)所需的必要各個溫度區(qū)并同時形成用于空間融解曲線分析的線性溫度梯度區(qū)間，實現(xiàn)功能的高效集成；(2)消除以往采用獨立恒溫區(qū)設(shè)計中各溫區(qū)之間熱絕緣的需求，實現(xiàn)整體熱結(jié)構(gòu)的緊湊化和微型化；(3)減少PCR熱循環(huán)過程中的能源消耗，簡化溫度控制，以及降低儀器成本。
[0032]熱梯度微反應(yīng)器主要包括:發(fā)熱基底、微通道、加熱元件、溫度傳感器、凸出塊、散熱片和微型渦輪風(fēng)扇組成。
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