留于磁鐵下方的濾膜上，并用2毫升Hank平衡鹽溶液進行清洗。
[0043]其中，所用稀有細(xì)胞富集裝置I的結(jié)構(gòu)如圖1和2所示，其具體結(jié)構(gòu)參數(shù)和操作參數(shù)如下:
[0044]結(jié)構(gòu)參數(shù):通道C的高度為10厘米，內(nèi)管2A的直徑為5厘米，通道C的寬度(即內(nèi)外管間距)為0.5毫米；
[0045]操作參數(shù):細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度約為40萬/毫升，負(fù)壓力產(chǎn)生的進料速度為I毫升/分鐘。
[0046](3)循環(huán)上皮細(xì)胞的染色
[0047]將濾膜取出，在濾膜上加入100微升4wt%多聚甲醛水溶液，孵育15分鐘以固定濾膜上的細(xì)胞。固定完成后，在濾膜上加入PBS緩沖液清洗濾膜，同時在濾膜下方用海綿吸去多余緩沖液，然后在濾膜上加入100微升0.2wt % Triton X-100細(xì)胞透膜液，孵育15分鐘以增加循環(huán)上皮細(xì)胞細(xì)胞膜對染色劑的通透性。透膜完成后，用PBS緩沖液清洗濾膜，然后在濾膜上加入100微升封閉液(PBS緩沖液，包含1wt%山羊血清與3wt%牛血清白蛋白)對經(jīng)固定透膜的細(xì)胞進行封閉，減少染色劑的非特異性結(jié)合，降低熒光信號的背景噪聲。常溫封閉I小時后，用PBS緩沖液清洗，然后加入100微升染色液(FITC熒光素標(biāo)記的ant1-pan-CK抗體和APC熒光素標(biāo)記的ant1-CD45抗體按體積比1:1配置的混合液)，常溫孵育2小時，再用PBS緩沖液清洗去除多余的染色液，最后加入100微升核染色試劑DAPI(20yg/mL)對細(xì)胞核進行染色，待PBS緩沖液清洗后完成循環(huán)上皮細(xì)胞的染色。
[0048](4)循環(huán)上皮細(xì)胞的鑒定
[0049]將步驟(3)經(jīng)染色處理的濾膜在熒光顯微鏡下觀察，依次選擇CY5、FITC和DAPI的濾玻片，觀察通道表面熒光顏色，顯藍色則DAPI +，不顯藍色則DAP1-，顯綠色則CK+，不顯綠色則CK-，顯紅色則CD45+，不顯紅色則CD45-，根據(jù)熒光顯色，當(dāng)DAPI+/CK+/CD45-且滿足一定形態(tài)學(xué)特征的為循環(huán)上皮細(xì)胞，DAPI+/CK-/⑶45+的為白細(xì)胞，DAP1-的為無核紅細(xì)胞或其他背景信號，由此可對所有的循環(huán)上皮細(xì)胞進行計數(shù)，從而獲得外周血樣本中循環(huán)上皮細(xì)胞的數(shù)目。
[0050]實施例2
[0051 ] 靈敏度與穩(wěn)定性實驗
[0052]將5、10、50、100個結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT116 用染料Vybrant DiI (LifeTehnologies)染色后各摻入I毫升健康人血液中，然后用實施例1的方法捕獲腫瘤細(xì)胞，每個實驗重復(fù)3次。捕獲結(jié)束后直接用熒光顯微鏡計數(shù)芯片中的HCT116細(xì)胞來計算捕獲效率和實驗偏差。結(jié)果表明:摻入5、10、50、100個腫瘤細(xì)胞所對應(yīng)的捕獲效率與實驗偏差分別為73±12%、77±12%、79±6%、78±4%，能夠達到臨床樣本檢測所需的靈敏度與穩(wěn)定性。
[0053]實施例3
[0054]單細(xì)胞回收與測序?qū)嶒?br>[0055]將100個非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975用染料Vybrant DiI(Life Tehnologies)染色后摻入I毫升健康人血液中，然后用實施例1的方法捕獲腫瘤細(xì)胞，其中回收細(xì)胞的微濾膜使用的是如圖所示的具有雙層結(jié)構(gòu)的微濾膜，其底部為厚度僅I微米的氮化硅薄膜。捕獲結(jié)束后直接用熒光顯微鏡計數(shù)濾膜上的H1975細(xì)胞的位置，并通過細(xì)針沖擊H1975細(xì)胞所在微孔底部的機械脆性的氮化硅膜，使整個氮化硅薄膜碎裂連同細(xì)胞掉入位于其正下方用于細(xì)胞回收的384孔板的孔中，其中孔中事先添加了 4微升磷酸緩沖液。然后將細(xì)胞裂解，并采用REPL1-g Single Cell Kit(Qiagen，USA)對單細(xì)胞全基因組進行放大。具體步驟為，在含有H1975細(xì)胞的孔中加入3微升變性液65°C高溫孵育10分鐘后，加入3微升終止緩沖液終止變性。然后，依次加入29微升反應(yīng)液、2微升phi 29DNA聚合酶，并補水至體積50微升，30度反應(yīng)8小時，最后65°C高溫繼續(xù)反應(yīng)3分鐘使酶失活，終止整個放大過程。酚氯仿乙醇沉淀進行提純后用于后續(xù)的目的基因擴增。
[0056]我們檢測EGFR基因20外顯子中的L858R突變以及21外顯子中的T790M突變，使用的引物為EGFR 20F(CTTTATCCAATGTGCTCCTC)、EGFR 20R(TCTCCCTTCCCTGATTACCT)、EGFR 21F(TTCGCCAGCCATAAGTCCT)以及EGFR 21R(TCATTCACTGTCCCAGCAAG)，并選擇退火溫度59°C，30個循環(huán)。實驗結(jié)果顯示，所回收的H1975細(xì)胞成功擴增出EGFR基因的20、21外顯子，并通過Sanger測序檢測到H1975細(xì)胞所具有L858R和T790M突變，從而證明了該技術(shù)的可行性。
【主權(quán)項】
1.一種稀有細(xì)胞富集裝置，包括: 細(xì)胞篩選部分，其包含形成在兩個相對表面之間的細(xì)胞篩選通道，兩個相對表面中的至少一個表面為磁性吸附表面，其特征在于: 其中所述細(xì)胞篩選通道的厚度設(shè)置為0.1毫米至5毫米， 所述裝置還包括: 細(xì)胞收集部分，其包含過濾單元，其可拆卸地設(shè)置于所述細(xì)胞篩選部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于，所述細(xì)胞篩選部分包含具有磁性吸附表面的磁性部及具有非磁性吸附表面的非磁性部， 其中所述磁性吸附表面以及所述非磁性吸附表面分別構(gòu)成所述兩個相對表面中的一個，且 其中沿所述細(xì)胞篩選通道內(nèi)細(xì)胞懸液的流動方向，所述磁性部的磁性逐步增強，以在所述磁性吸附表面均勻吸附結(jié)合不同數(shù)量免疫磁球的所述多數(shù)細(xì)胞。3.如權(quán)利要求2所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于所述磁性部包括內(nèi)管和容納其中的磁體，所述非磁性部為套著所述內(nèi)管的外管，所述細(xì)胞篩選通道界定在所述內(nèi)管的外表面與所述外管的內(nèi)表面之間，沿所述細(xì)胞篩選通道內(nèi)細(xì)胞懸液的流動方向所述磁體的體積逐步增大。4.如權(quán)利要求1或2所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于所述過濾單元包括具有細(xì)胞截留孔的微濾膜，該細(xì)胞截留孔的孔徑為3-8微米。5.如權(quán)利要求1或2所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于所述過濾單元包括雙層結(jié)構(gòu)的濾膜，該濾膜的上層為具有微孔的微孔板，下層為具有細(xì)胞截留孔的微濾膜，所述微孔的尺寸設(shè)置為允許所述稀有細(xì)胞通過，而所述細(xì)胞截留孔的尺寸設(shè)置為不允許所述稀有細(xì)胞通過，且所述微孔的孔徑為所述細(xì)胞截留孔的5-20倍； 且其中所述微濾膜的細(xì)胞截留孔位于所述微孔板的對應(yīng)微孔的下方，用以截留進入微孔中的稀有細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于所述細(xì)胞截留孔的孔徑為4-6微米，且所述微孔的孔徑為所述細(xì)胞截留孔的8-15倍。7.如權(quán)利要求1所述的稀有細(xì)胞富集裝置，其特征在于，所述細(xì)胞篩選通道的厚度為.0.1毫米至1毫米。
【專利摘要】一種稀有細(xì)胞富集裝置，其包括：細(xì)胞篩選部分，其包含形成在兩個相對表面之間的細(xì)胞篩選通道，兩個相對表面中的至少一個表面為磁性吸附表面，其中所述細(xì)胞篩選通道的厚度設(shè)置為0.1毫米至5毫米。還包括：細(xì)胞收集部分，其包含過濾單元，其可拆卸地設(shè)置于所述細(xì)胞篩選部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有細(xì)胞。本實用新型解決了通過負(fù)選富集稀有細(xì)胞時容易導(dǎo)致稀有細(xì)胞丟失的吸附裹挾和離心損失的兩個關(guān)鍵問題，因此能獲得較高的稀有細(xì)胞回收率。
【IPC分類】C12M1/12, C12M1/00
【公開號】CN205258443
【申請?zhí)枴緾N201520981359
【發(fā)明人】閻灼輝
【申請人】蘇州浚惠生物科技有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年12月1日