全自動(dòng)核酸提取與pcr擴(kuò)增微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地說，本實(shí)用新型涉及一種全自動(dòng)核酸提取與PCR擴(kuò)增微流控芯片結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0002]流控芯片在核酸提取與PCR擴(kuò)增中已經(jīng)有了很多應(yīng)用，但大多數(shù)的應(yīng)用還停留在實(shí)驗(yàn)室階段。原因是為了實(shí)現(xiàn)血樣或組織的裂解、核酸綁定、清洗、洗脫等過程，這些核酸提取與PCR擴(kuò)增微流控芯片上都集成有很多的微栗和微閥，增加了微流控芯片的復(fù)雜性、制造難度、成本，降低了可靠性。同時(shí)，外部驅(qū)動(dòng)這些栗、閥所需要的設(shè)備和裝置也比較復(fù)雜，限制了這些芯片向臨床的應(yīng)用。
[0003]由此，本實(shí)用新型摒棄現(xiàn)有核酸檢測(cè)PCR芯片上集成的栗和閥，提出利用旋轉(zhuǎn)器械的離心力作為驅(qū)動(dòng)，并輔助以毛細(xì)力和虹吸現(xiàn)象來實(shí)現(xiàn)全部流體的功能操控。整個(gè)核酸提取、純化和PCR反應(yīng)過程中的流體操控只需要一臺(tái)旋轉(zhuǎn)離心設(shè)備即可完成。整個(gè)微流控芯片上無任何集成的栗、閥設(shè)備，大大降低了芯片的制造難度和成本，并提高了芯片的可靠性，對(duì)于核酸提取與PCR擴(kuò)增的臨床應(yīng)用具有積極意義。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004]本實(shí)用新型的目的是提出了一種利用離心力、毛細(xì)力以及虹吸現(xiàn)象來實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)核酸提取與PCR反應(yīng)的微流控芯片，該微流控芯片上無任何集成的栗、閥設(shè)備，大大降低了芯片的制造難度和成本，并提高了芯片的可靠性。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本實(shí)用新型的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種全自動(dòng)核酸提取與PCR擴(kuò)增微流控芯片，包括至少一個(gè)主體，沿芯片圓周等距分布，所述主體包括:
[0006]核酸提取單元，其位于所述主體上，用于在離心力和毛細(xì)力的驅(qū)動(dòng)下順序進(jìn)行核酸的萃取、清洗、洗脫；
[0007]PCR擴(kuò)增單元，其位于所述主體上，其與所述核酸提取單元通過三叉流道相連，用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增；
[0008]廢液?jiǎn)卧浒◤U液腔體，與所述核酸提取單元通過三叉流道相連，用于存儲(chǔ)廢液；
[0009]以及排氣單元，其包括排氣孔和多條排氣流道，所述多條排氣流道與核酸提取單元、PCR擴(kuò)增單元、廢液腔體連通，用于排放氣體。
[0010]優(yōu)選的是，所述核酸提取單元包括:
[0011 ]加樣裝置，其位于主體的左上端，所述加樣裝置包括加樣腔體及設(shè)置在加樣腔體上的加樣孔，所述加樣裝置用于加入和存放樣品與裂解液、綁定液的混合物；
[0012]清洗裝置，其位于主體的中上端，所述清洗裝置包括清洗液加樣孔和清洗液腔體，所述清洗裝置用于加入和存放清洗液；
[0013]洗脫裝置，其位于主體的右上端，所述洗脫裝置包括洗脫液加樣孔和洗脫液腔體，所述洗脫裝置用于加入和存放洗脫液；
[0014]以及核酸固相萃取裝置，其包括核酸固相萃取腔體，所述核酸固相萃取腔體內(nèi)設(shè)置有核酸固相萃取材料；
[0015]其中所述加樣腔體通過第一流道與所述核酸固相萃取腔體連通，所述清洗液腔體通過第二流道與所述核酸固相萃取腔體連通，所述洗脫液腔體通過第三流道與核酸固相萃取腔體所述連通。
[0016]優(yōu)選的是，所述PCR擴(kuò)增單元包括:
[0017]核酸定量流道，其與核酸固相萃取單元通過三叉流道連通；
[0018]核酸定量腔體，其與核酸定量流道連通，用于定量核酸；
[0019]PCR反應(yīng)腔體，其與核酸定量腔體通過第六流道連通，所述PCR腔體為封閉腔體，內(nèi)部放置有PCR反應(yīng)所需引物及試劑；
[0020]以及多余核酸腔體，其與核酸定量流道連通，用于存儲(chǔ)多余的核酸。
[0021]本實(shí)用新型的另一個(gè)目的是提供全自動(dòng)核酸提取與PCR擴(kuò)增微流控芯片的應(yīng)用方法，包括如下步驟；
[0022]步驟I):將全自動(dòng)核酸提取與PCR擴(kuò)增微流控芯片安裝在離心機(jī)上，再經(jīng)加樣孔向加樣腔體中加入樣品與裂解液、綁定液的混合物，向清洗液腔體中加入清洗液，向洗脫液腔體中加入洗脫液。
[0023]步驟2):順時(shí)針旋轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)速1200?1600rpm，時(shí)間3?5分鐘。樣品與裂解液、綁定液混合物將經(jīng)第一流道后進(jìn)入固相萃取腔體，清洗液將經(jīng)第四流道、清洗液二級(jí)腔體、第三流道后既進(jìn)入固相萃取腔體;而洗脫液將在離心力作用下進(jìn)入洗脫液二級(jí)腔體中，溶液達(dá)到第二流道的虹吸管后，由于強(qiáng)大的離心力大于毛細(xì)力，洗脫液無法經(jīng)第二流道進(jìn)入固相萃取腔體；
[0024]同時(shí)，由于第一流道相對(duì)于第三流道具有更低的流體阻力，可以使得在樣品與裂解液、綁定液的混合物完全流出固相萃取腔體時(shí)，清洗液依然沒有到達(dá)固相萃取腔體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)萃取與清洗的順序執(zhí)行；
[0025]由于為順時(shí)針高速離心，在科里奧利力的作用下，使得樣品與裂解液、綁定液的混合物以及清洗液都將經(jīng)三叉流道流向廢液腔體，而不會(huì)流向核酸定量流道。
[0026]步驟3):速至O后逆時(shí)針低俗旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速20?80rpm，時(shí)間20?60s，此時(shí)由于離心較小，使得洗脫液可以由毛細(xì)力充滿整個(gè)第二流道。
[0027]步驟4):逆時(shí)針高速離心，轉(zhuǎn)速1200?1600rpm，時(shí)間60?120s，在離心力的作用下，利用虹吸現(xiàn)象將洗脫液經(jīng)第二流道后流向固相萃取腔體，并在科里奧利力的作用下將洗脫完的核酸經(jīng)三叉流道后流向定量流道，并依次充滿核酸定量腔體，多余的核酸流入廢液腔體，完成核酸的洗脫;此時(shí)由于第六流道具有較小的橫截面尺寸，且PCR反應(yīng)腔體為封閉腔體，使得離心力不足以克服第六流道的毛細(xì)力與樣品腔體的內(nèi)壓力，而核酸無法進(jìn)入PCR反應(yīng)腔體。
[0028]步驟5):進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)速，1800?2500rpm，時(shí)間20?40s，在更為強(qiáng)大的離心力作用下，洗脫完的核酸經(jīng)定量腔體后進(jìn)入PCR反應(yīng)腔體，并與PCRmix、引物的結(jié)合，在外部溫控的控制下完成PCR擴(kuò)增，所述轉(zhuǎn)速優(yōu)選2500rpm。
[0029 ]優(yōu)選的是，所述PCR反應(yīng)所需的試劑或弓丨物包含PCRmi x、PCR引物，所述試劑或者弓I物以凍干或風(fēng)干形式存放于PCR反應(yīng)腔體內(nèi)。
[0030]優(yōu)選的是，所述固相萃取腔體具有細(xì)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，且長(zhǎng)度方向指向芯片中心，以保證在離心力作用下，流體能有較少殘留；所述固相萃取腔體具有長(zhǎng)方形橫截面，其等效直徑Imm?2_，長(zhǎng)度5mm?15mm ；所述固相萃取材料選自娃膠膜、娃膠柱中的一種。
[0031]優(yōu)選的是，所述清洗液腔體包括清洗液一級(jí)腔體和清洗液二級(jí)腔體，清洗液一級(jí)腔體和清洗液二級(jí)腔體通過第四流道連通，所述洗脫液液腔體包括洗液不會(huì)進(jìn)入清洗液二級(jí)腔體，更不會(huì)進(jìn)入第三流道，進(jìn)而提前進(jìn)入固相萃取腔體;所述方案增加了一個(gè)洗脫液二級(jí)腔體，此設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于，由于第五流道的存在，在毛細(xì)力和表面張力的存在，洗脫液不會(huì)進(jìn)入洗脫液二級(jí)腔體，更不會(huì)第二流道，進(jìn)而提前進(jìn)入固相萃取腔體。
[0032]優(yōu)選的是，所述第二流道為虹吸流道，所述洗脫液二級(jí)腔體經(jīng)虹吸流道連接到固相萃取腔體，此設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于，由于虹吸流道的存在，使得在第一次順時(shí)針離心下，洗脫液不會(huì)經(jīng)虹吸流道提前進(jìn)入固相萃取腔體；只有在第二次反向離心時(shí)，洗脫液才會(huì)經(jīng)虹吸流道進(jìn)入固相萃取腔體;所述虹吸流道的等效直徑為0.8mm?1.5mm，以保證其具有較小的流體阻力;所述虹吸流道距離芯片中心的最小距離小于洗脫液二級(jí)腔體距離芯片中心最小處的距離;所述第三流道具有局部增加流體阻力流道結(jié)構(gòu)，所述流道結(jié)構(gòu)具有較小的等效直徑，且為” S”型；所述第四流道和所述第五流道具有等效直徑0.4mm?0.8mm;以保證其具有合適的毛細(xì)力和流體阻力，在靜止時(shí)溶液不會(huì)流出，在離心時(shí)溶液可以快速流出。
[0033]優(yōu)選的是，所述第六流道具有等效直徑0.1mm?0.2mm ；所述的加樣腔體具有體積500?800μ1;所述的清洗液腔體、清洗液二級(jí)腔體具有體積500?800μ1;所述的洗脫液腔體、洗脫液二級(jí)腔體具有體積150?200μ1;所述核酸定量腔體具有體積40μ1;所述PCR反應(yīng)腔體具有體積35μ1。
[0034]優(yōu)選的是，本方案所述主體還可以具有多個(gè)清洗液一級(jí)腔體和清洗液二級(jí)腔體，以滿足可以用多種不同的清洗液進(jìn)行清洗，或者更多量的同一種清洗液清洗;可以包含多個(gè)核酸定量腔體與PCR反應(yīng)腔體，各個(gè)PCR腔體中放置有不同的核酸反應(yīng)試劑，以便于檢測(cè)多個(gè)不同的靶標(biāo);本方案芯片可以包含多個(gè)這樣的核酸提取與PCR反應(yīng)的結(jié)構(gòu)，以便于同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)不同的樣本，其沿芯片圓周等距分布。
[0035]本實(shí)用新型所述芯片適用于可實(shí)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)離心的設(shè)備上，利用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力與毛細(xì)力、虹吸現(xiàn)象，將加入樣品腔體的樣品與裂解液、綁定液混合物、加入清洗液腔體的清洗液、加入洗脫液腔體的洗脫液依次流經(jīng)固相萃取腔體，達(dá)到核酸裂解、吸附、洗脫的目的。洗脫完的核酸經(jīng)定量腔體定量后流入PCR反應(yīng)腔體，并在這里與PCR試劑、引物、探測(cè)等進(jìn)行結(jié)合完成PCR反應(yīng)。
[0036]本實(shí)用新型至少包括以下有益效果:
[0037](I)本實(shí)用新型的微流控芯片利用離心力、毛細(xì)力以及虹吸現(xiàn)象來實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)核酸提取與PCR反應(yīng)的，沒有集成微栗和微閥，使得其制造難度與成本相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有顯著降低，同時(shí)又提高了芯片的可靠性，對(duì)于提高芯片的產(chǎn)率和可靠性及檢測(cè)精度、降低制作成本具有重要意義；
[0038](2)本實(shí)用新型的微流控芯片集核酸提取、PCR擴(kuò)增為一體，方便了實(shí)驗(yàn)操作，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0039]本實(shí)用新型的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本閥門的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0040]圖1為本實(shí)用新