本發(fā)明涉及一種熒光探針及其制備方法，以及其在水溶液中、凝膠中和細胞中檢測核酸G-四鏈體二級結(jié)構(gòu)的用途。

背景技術(shù)：

核酸不但是一切生物細胞的基本成分，還對生物體的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等重大生命現(xiàn)象起主宰作用。核酸大分子分為兩類：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。

G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的核酸二級結(jié)構(gòu)。人類基因組中很多富鳥嘌呤區(qū)域具有形成這一結(jié)構(gòu)的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復(fù)序列，以及多種基因的啟動子區(qū)域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰島素基因等。G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，鏈的數(shù)量和取向、loop的連接方式以及鳥嘌呤的糖苷扭轉(zhuǎn)角以及與羰基負電中心配位的金屬離子等多方面決定了G-四鏈體的類型和構(gòu)象，這些差異性也為蛋白和小分子化合物提供了多個識別位點。根據(jù)鏈的取向不同，G-四鏈體分為正平行，反平行與混合型三種構(gòu)象。

G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成對于體內(nèi)的一系列生理過程都存在調(diào)控作用。研究證明，某些啟動子區(qū)域的G-四鏈體結(jié)構(gòu)會顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)被認為是起到分子開關(guān)的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導(dǎo)、細胞凋亡和細胞增殖等一系列體內(nèi)重要的生理過程。所以，在體內(nèi)或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈體結(jié)構(gòu)的存在或者形成，對于研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)的相關(guān)生物學功能以及開發(fā)以G-四鏈體結(jié)構(gòu)為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對于核酸標記的要求越來越高，以往通過同位素效應(yīng)來進行DNA分子測序的方法已經(jīng)無法滿足需求，而熒光標記作為一種具有檢測速度快、重復(fù)性好、用樣量少、無輻射等優(yōu)點的標記技術(shù)受到廣泛重視，并取得迅速發(fā)展。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的染色劑有卟啉類、菁類、苯乙烯類等。而其中的噻唑橙(TO)是一種經(jīng)典的非選擇性菁類核酸熒光探針。除了與其他核酸結(jié)合后產(chǎn)生熒光外，TO同樣可以結(jié)合在G-四鏈體上，產(chǎn)生強烈的熒光。但是，TO不能從其他形式的核酸分子中有效地識別G-四鏈體二級結(jié)構(gòu)，因而選擇性較差限制了TO的應(yīng)用。為了改良TO的選擇性，我們在TO的結(jié)構(gòu)上引入了苯乙烯基團，得到了一類結(jié)構(gòu)新穎的，且對核酸G-四鏈體結(jié)構(gòu)專一性強的的熒光探針。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熒光探針。

本發(fā)明的另一個目的在于提供上述探針的制備方法。

本發(fā)明的再一個目的在于提供上述探針在檢測水溶液中、凝膠中和細胞中G-四鏈體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明提供了一種熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為下式I所示：

式中R₁選自或

R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分別選自H、F、Cl、Br、OH、OCH₃、N(CH₃)₂、C_1-6的烷基或C_3-6的環(huán)烷基；

X為C或N。

本發(fā)明同時提供了上述探針的制備方法，表示如下：

具體步驟為：

將4-氯-2-甲基喹啉與碘甲烷反應(yīng)，得到化合物將2-甲基苯并噻唑與碘甲烷反應(yīng)，得到然后將和反應(yīng)，得到 最后將和不同取代基的芳香醛反應(yīng)，得到最終探針化合物

本發(fā)明還提供了上述探針在檢測水溶液中、凝膠中和細胞中G-四鏈體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的探針由于具有較大的電子共軛體系和平面，探針分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的強弱可以影響分子的熒光發(fā)射強度。當與G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性的作用后，分子內(nèi)的可轉(zhuǎn)動的雙鍵的柔性受到限制，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強，熒光也有明顯增強。同時，該類探針的分子結(jié)構(gòu)的柔性的共軛平面，具有可以轉(zhuǎn)動的鍵，使其可以比較容易堆積在G四分體的平面上，進而與G-四鏈體具有較強的作用力，同時與其他二級結(jié)構(gòu)的核酸作用較弱。所以，將該探針與不同二級結(jié)構(gòu)的核酸混合時，如果該核酸是G-四鏈體結(jié)構(gòu)時，其與探針分子間的特異性作用，產(chǎn)生熒光光譜的改變。當核酸的二級結(jié)構(gòu)為其他結(jié)構(gòu)時，則不會產(chǎn)生明顯的信號變化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(1)該類探針制備簡單，易得，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，便于儲存。

(2)本發(fā)明提供的探針具有較低的生物毒性、光毒性和光漂白性，且光穩(wěn)定性佳。

(3)本發(fā)明提供的探針具有良好的水溶性和良好的細胞膜通透性。

(4)本發(fā)明提供的探針的光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異，在非G-四鏈體存在的溶液及細胞內(nèi)具有較低的熒光背景。

(5)本發(fā)明提供的探針可以特異性地檢測識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了G-四鏈體結(jié)構(gòu)與其他二級結(jié)構(gòu)的區(qū)分，用簡單的熒光光譜儀，甚至只需普通紫外燈照射下，肉眼觀察就可以識別出核酸樣品的二級結(jié)構(gòu)，快捷，操作簡便，成本低廉，并且可以實現(xiàn)實地檢測。

附圖說明

圖1為為探針6a與AT、DA21、LQ1、Oxy28、random、RNA六種核酸在1∶1濃度 下的熒光譜。

圖2為探針6a滴定四鏈DNA(Oxy28)的熒光光譜。

圖3為探針6a滴定四鏈DNA(Oxy28)的熒光光譜中C與(F-F₀)/F₀擬合的曲線.

圖4為探針6a與雙鏈DNA(ds26)和G-四鏈體(Oxy28)的聚丙酰胺凝膠電泳圖

圖5為染料DAPI染PC3細胞的細胞成像圖.

圖6為探針6a染PC3細胞的細胞成像圖.

圖7為探針6a與染料DAPI復(fù)染PC3細胞的細胞成像圖.

具體實施方式

以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。通過熒光光譜實驗證明，本發(fā)明涉及的化合物6a由于具有較大的電子共軛體系和平面，與G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性的堆積作用后，熒光光譜發(fā)生明顯變化，熒光強度增加百倍，甚至只需普通紫外燈照射下，肉眼觀察，同時與其他二級結(jié)構(gòu)的核酸作用較弱，沒有明顯的熒光信號響應(yīng)，使該類探針具有很好的特異性識別作用。所以，我們將該探針與不同二級結(jié)構(gòu)的DNA混合時，當該DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)時，其與探針分子間的特異性作用，產(chǎn)生熒光光譜的改變。當DNA的二級結(jié)構(gòu)為其他結(jié)構(gòu)時，則不會產(chǎn)生明顯的信號變化。以其中化合物6a為例來說明本發(fā)明的熒光探針在熒光法(包括熒光顯微鏡和熒光凝膠成像儀)檢測水溶液中、凝膠中和細胞中G-四鏈體核酸二級結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

實施例一：化合物2的合成

往25ml圓底燒瓶里稱取4-氯-喹哪啶0.2g(1.1236mmol)，加入碘甲烷，溶劑環(huán)丁砜，將混合物加熱到40～60℃，反應(yīng)18個小時后，冷卻，加入無水乙醚后震蕩，抽濾，固體洗滌數(shù)遍，真空干燥后稱重，薄層色譜法初步表明沒有副產(chǎn)物，得到0.345g純品2，產(chǎn)率為95.8％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.22(t，J＝8.1Hz，1H)，8.01(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(s，J＝7.4Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.74(s，1H)，2.68(s，3H).

實施例二：化合物4的合成

往25ml的圓底燒瓶里稱取2-甲基-苯并噻唑0.25g(1.68mmol)，加入碘甲烷、溶劑無水乙醇，80℃下反應(yīng)15個小時后，將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，然后加入無水乙醇和三氯甲烷混合液，振蕩后抽濾，并用少量試劑洗滌沉淀，真空干燥后得到白色粉末狀固體0.448g，收率為91.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(d，J＝8.1Hz，1H)，8.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.90(t，J＝7.8Hz，1H)，7.81(t，J＝7.7Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.54(s，1H)，3.17(s，3H)。

實施例三：化合物5的合成

稱取化合物2和3各0.50g，加入到裝有10ml甲醇的圓底燒瓶中，室溫條件下攪拌后加入少量0.5mol/L碳酸氫鈉水溶液，敞開攪拌約1小時。向反應(yīng)后的溶液中加入4ml飽和KI溶液，攪拌約5分鐘后抽濾，再用水洗，丙酮洗，最終得到磚紅色固體，干燥過濾并濃縮后柱層析純化，得0.98g化合物4，產(chǎn)率為81.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.77(d，J＝8.3Hz，1H)，8.18(d，J＝8.7Hz，1H)，8.02-7.96(m，2H)，7.74(d，J＝8.2Hz，2H)，7.59(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(s，1H)，6.85(s，1H)，4.07(s，3H)，3.98(s，3H)，2.87(s，3H)。

實施例四：化合物6a的合成

稱取0.0756g(0.170mmol)的M₃于25ml的圓底燒瓶中，加入2倍摩爾量的4，4-二甲基氨基-苯甲醛0.0505g、溶劑正丁醇、4-甲基哌啶數(shù)滴，在120～150℃下反應(yīng)3個小時，冷卻后抽濾，用正丁醇和冰水配置的混合溶液洗滌固體，真空干燥稱重后得72mg，產(chǎn)率73.4％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.70(d，J＝8.3Hz，1H)，8.13(d，J＝8.8Hz，1H)，8.03(d，J＝7.7Hz，1H)，7.97-7.92(m，1H)，7.79(d，J＝8.9Hz，2H)，7.71(d，J＝7.8Hz，1H)，7.69-7.64(m，2H)，7.63(s，1H)，7.56(t，J＝7.8Hz，1H)，7.43(d，J＝15.7Hz，1H)，7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，6.79(d，J＝9.1Hz，3H)，4.13(s，3H)，3.94(s，3H)，3.05(s，6H)。

實施例五：化合物6b的合成

合成方法同6a，得70mg黑色固體6b，產(chǎn)率76.5％：¹H NMR：(400MHz，DMSO-d₆)δ12.00(s，1H)，8.72(d，J＝8.0H_Z，1H)，8.18(d，J＝16.0H_Z，3H)，8.00(m，3H)，7.69(m，3H)，7.58(d，J＝8.0H_Z，2H)，7.47(d，J＝12.0H_Z，1H)，7.35(t，J＝8.0H_Z，1H)，7.27(s，2H)，6.82(s，1H)，4.19(s，3H)，4.94(s，3H)。

實施例六：化合物6c的合成

合成方法同6a，得79mg紫色固體6c，產(chǎn)率83.5％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.70(d，J＝8.5Hz，1H)，8.12(d，J＝8.9Hz，1H)，8.07(d，J＝7.9Hz，1H)，7.95(t，J＝7.8Hz，1H)，7.73-7.68(m，2H)，7.59(dd，J＝13.5，7.0Hz，3H)，7.49(d，J＝8.7Hz，2H)，7.39(t，J＝7.6Hz，1H)，7.17(dd，J＝24.7，13.8Hz，3H)，6.83-6.76(m，3H)，4.09(d，J＝8.5Hz，3H)，3.96(s，3H)，3.00(d，J＝11.7Hz，6H)

實施例七：化合物6d的合成

合成方法同6a，得76mg紅色固體6d，產(chǎn)率77.4％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.69(d，J＝8.4Hz，1H)，8.01(ddd，J＝13.8，10.1，7.4Hz，4H)，7.94-7.89(m，1H)，7.69(t，J＝7.4Hz，1H)，7.64(d，J＝4.5Hz，1H)，7.60(d，J＝9.5Hz，1H)，7.58-7.49(m，2H)，7.44(s，1H)，7.34(dd，J＝19.2，8.3Hz，3H)，6.79(s，1H)，4.07(s，3H)，3.92(s，3H).

實施例八：化合物6e的合成

合成方法同6a，得82mg褐色固體6e，產(chǎn)率85.6％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.10(s，1H)，8.77(s，1H)，8.66(d，J＝3.7Hz，1H)，8.39(d，J＝7.3Hz，1H)，8.17(s，1H)，8.06(d，J＝7.5Hz，1H)，7.99(s，1H)，7.91(d，J＝15.9Hz，1H)，7.74(s，2H)，7.67(d，J＝18.3Hz，1H)，7.65-7.52(m，3H)，7.41(s，1H)，6.91(s，1H)，4.16(s，3H)，4.00(s，3H).

實施例九：化合物6f的合成

合成方法同6a，得80mg紫黑色固體6e，產(chǎn)率83.2％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.73(t，J＝10.7Hz，1H)，8.10(dd，J＝18.2，9.6Hz，2H)，7.97-7.92(m，1H)，7.74-7.68(m，2H)，7.67-7.61(m，2H)，7.60-7.51(m，3H)，7.45(dd，J＝13.6，5.9Hz，2H)，7.42-7.35(m，3H)，7.31(d，J＝15.2Hz，2H)，6.83(d，J＝9.2Hz，1H)，4.06(d，J＝14.2Hz，3H)，3.97(d，J＝7.1Hz，3H).

實施例十：核酸選擇性

DNA配置：DNA樣品購自英駿生物技術(shù)有限公司。將DNA適量溶于Tris-HCl的緩沖液中(PH 7.4，100mM Tris，60mM KCl)或者Tris-醋酸緩沖中(PH 5.5，100mM Tris，60mM KCl)，超微量紫外定濃，在95℃下加熱5min后緩慢冷卻退火到室溫作為儲存液，4℃儲存。

將5mM的化合物儲備液稀釋成5uM的濃度，再加入不同種類的核酸用熒光分光光度計(狹縫寬度＝10，掃描速度＝200，Ex＝475nm)測出其各自的熒光強度，發(fā)現(xiàn)這一系類化合物與G-四鏈體DNA的結(jié)合之后熒光強度最強.

DNA序列

實施例十一：檢測限的測定

將5mM的化合物儲備液稀釋成5uM的濃度，再在熒光分光光度計(狹縫寬度＝10，掃描速度＝200，Ex＝475nm)掃描，再往其中慢慢加入Oxy28的DNA做到使其飽和.檢測限的計算公式

LOD＝K×S_b/m

LOD(化合物的檢測限)，m是濃度C與(F-F₀)/F₀的所做直線的斜率，S_b為用儀器空白多次測量的標準偏差，K值按照國際純粹和應(yīng)用化學聯(lián)合會建議通常取為3，6a測得的LOD為0.87nM.

實施例十二：核酸凝膠電泳實驗

先將5×TBE電泳緩沖液、過硫酸銨10％m/V、6X載樣緩沖液、亞甲雙丙酰胺(29∶1)(％，m/V)配好，接著安裝電泳裝置和配置凝膠溶液，灌制凝膠，待凝膠冷卻之后取出梳子和隔板，放入電泳槽中，緩沖液淹沒過膠1-2mm為止，DNA樣品配成5μM(混合液中上樣緩沖液為1×)，取10μL加入凝膠點樣孔中，將整個電泳儀接通，45V電壓跑1h，接著100V電壓跑3h，取出凝膠塊，再將凝膠塊放入染色劑和化合物中泡染，染過之后吹干，將其置于凝膠電泳儀上觀察.

實施例十三：細胞成像實驗

先將細胞接種于6孔板中，使細胞的密度約為2×10³個/mL，然后在37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)24h。接著棄去上步6孔板中的細胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，然后再加入預(yù)冷的純甲醇1.5mL常溫避光放置1min，最后棄去純甲醇并再用預(yù)冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5μM的化合物然后放置15min。棄去上步6孔板中的化合物溶液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1μM的DAPI溶液1mL并37℃放置2min，然后再用預(yù)冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。