本發(fā)明涉及一種具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針及應(yīng)用，具體涉及一種針對羥基自由基、巰基自由基、細(xì)胞氧化還原環(huán)境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價的熒光分析體系。

背景技術(shù)：

眾所周知，生物體是極其復(fù)雜的系統(tǒng)，而細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，對維持生物體細(xì)胞內(nèi)的正常生理功能極為重要。研究表明，細(xì)胞氧化還原環(huán)境的改變與一系列的疾病關(guān)系密切，如癌癥、缺血再灌注損傷以及神經(jīng)退化疾病如阿爾茨海默病等。因此，監(jiān)測細(xì)胞氧化還原環(huán)境的動態(tài)變化可以為臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供豐富的生理、病理信息。

細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)平衡是通過控制細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)(酶類、谷胱甘肽等)和氧化性物質(zhì)(活性氧、活性氮)的量，使這二者之間達(dá)到相對平衡來實現(xiàn)。一方面，活性氧、活性氮若在體內(nèi)過度產(chǎn)生，將會導(dǎo)致“氧化應(yīng)激”，產(chǎn)生的活性氧、活性氮超過機體的承受能力，會對機體產(chǎn)生氧化損傷，影響正常生理功能。比如，長期被輻射就會導(dǎo)致活性氧的大量增加，進(jìn)而引發(fā)自由基鏈反應(yīng)導(dǎo)致機體損傷。尤其是羥基自由基，被認(rèn)為是氧化能力最強的自由基，它在細(xì)胞和組織內(nèi)產(chǎn)生而且能夠進(jìn)攻產(chǎn)生位置的蛋白質(zhì)和糖類導(dǎo)致其分解、脂質(zhì)的過氧化和DNA的損傷。因此，如果能夠?qū)崟r在線的監(jiān)測羥基自由基，就能夠更好地研究其產(chǎn)生以及細(xì)胞損傷機制，設(shè)計一種有效的自由基檢測方法是目前生物學(xué)、化學(xué)界研究的熱點。發(fā)展高選擇性、高靈敏度、具有生物兼容性的自由基檢測方法是更加詳細(xì)地了解自由基造成的細(xì)胞氧化損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機制的關(guān)鍵。另一方面，當(dāng)活性氧在體內(nèi)過度產(chǎn)生，還原性物質(zhì)也會表達(dá)過多，產(chǎn)生還原應(yīng)激，也會導(dǎo)致機體發(fā)生病變。如谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)含量最高的小分子硫醇，是細(xì)胞內(nèi)重要的還原性物質(zhì)，能夠有效的清除細(xì)胞內(nèi)各種有害的自由基，然而產(chǎn)生過量谷胱甘肽自由基(GS·)因其強氧化性可以與蛋白質(zhì)硫醇以及不飽和脂肪鏈發(fā)生反應(yīng)而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而產(chǎn)生還原應(yīng)激，因此，阻斷GS·引發(fā)的二級氧化反應(yīng)破壞其他細(xì)胞組分具有重要作用。

此外，由于人類所接觸的各種輻射，如紫外輻射，電磁輻射等日益嚴(yán)重，由此導(dǎo)致的各種疾病如癌癥，心血管疾病等發(fā)生率越來越高，因而天然抗氧化劑或人工抗氧化劑也受到越來越廣泛的關(guān)注。因此尋求更簡便，能對抗氧化劑性能進(jìn)行比較研究的新方法，對抗氧化劑的修飾、優(yōu)化、篩選以及食品或飲料等抗氧化性能評價具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的就是提供一種用于羥基自由基、巰基自由基、細(xì)胞氧化還原環(huán)境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價的新型自旋標(biāo)記熒光探針，該探針對于羥基自由基和谷胱甘肽自由基的具有靈敏度高、選擇性好、產(chǎn)物簡單且易于分離等特點；將該探針應(yīng)用于細(xì)胞氧化還原環(huán)境檢測，具有簡便、選擇性好、靈敏度高等特點；此外，該探針對于多酚類化合物抗氧化性能評價具有良好的選擇區(qū)分性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針，是通過以下方法制備得到的：

(1)將羅丹明B和4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基加入到反應(yīng)溶劑二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(作為催化劑)，反應(yīng)20分鐘，再加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(作為脫水劑)，氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)24h；

所述羅丹明B、4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基、4-二甲氨基吡啶、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺四者的摩爾比為1:1:0.1:1；

(2)上述反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑(減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加熱溫度低于50℃)，將剩余的物料進(jìn)行柱色譜分離：以二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v)為洗脫劑，200目中性氧化鋁為固定相，收集洗脫液，除去洗脫劑(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，得紫紅色固體，即為具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針。

所述具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針，細(xì)胞滲透性好，細(xì)胞毒性低，可以用于細(xì)胞內(nèi)羥基自由基、巰基自由基、細(xì)胞氧化還原環(huán)境的檢測，以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價研究，具體應(yīng)用時，方法如下：

一種利用具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的方法，如下：首先，用魚藤酮刺激待檢測細(xì)胞；然后，將刺激后的待檢測細(xì)胞在濃度為0.5％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的DMSO溶液(二甲基亞砜溶液)中孵育30min，然后加入探針，繼續(xù)培養(yǎng)2h，進(jìn)行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)具有羥基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)不具有羥基自由基。

優(yōu)選的，所述用魚藤酮刺激待檢測細(xì)胞的具體方式為：用1μM魚藤酮預(yù)處理待檢測細(xì)胞30min。魚藤酮是呼吸鏈中復(fù)合酶Ⅰ的抑制劑，會導(dǎo)致活性氧的過量產(chǎn)生，由于魚藤酮的細(xì)胞毒性大，低濃度即可引起細(xì)胞凋亡等異?，F(xiàn)象。本發(fā)明采用1μM魚藤酮對細(xì)胞處理未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常變化及細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。

優(yōu)選的，所述加入的探針的濃度為1μM。

進(jìn)一步地，還可設(shè)置陽性對照，以羥基自由基作為陽性對照。

所述羥基自由基(體外)是通過經(jīng)典的Fenton體系制備的，即：過氧化氫在亞鐵離子催化([Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6)下產(chǎn)生羥基自由基。

所述待檢測細(xì)胞可以是各種病變細(xì)胞(比如肝癌細(xì)胞)，也可以是正常細(xì)胞(可以作為陰性對照)。

一種利用具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針檢測體外羥基自由基的方法，如下：將探針加入含有濃度為1％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的DMSO溶液的待檢測物(此處的1％指的是DMSO溶液的濃度)中，反應(yīng)30min，進(jìn)行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測物中具有羥基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測物中不具有羥基自由基。

優(yōu)選的，所述加入的探針的濃度為5μM，檢測羥基自由基的濃度范圍為0～100μM。

一種利用具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針檢測巰基自由基的方法，如下：將探針加入待檢測細(xì)胞或待檢測物中，預(yù)處理10min后，進(jìn)行熒光檢測及成像；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)或待檢測物中具有巰基自由基，若未檢測到熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)或待檢測物中不具有巰基自由基。

所述探針的濃度為2～5μM。

檢測巰基自由基的原理為：探針捕獲谷胱甘肽自由基生成相應(yīng)的熒光衍生物。體外谷胱甘肽自由基的生成方法采用辣根過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下氧化苯酚生成苯氧自由基，進(jìn)而氧化谷胱甘肽生成谷胱甘肽自由基。

一種利用具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的方法，如下：將細(xì)胞經(jīng)10mM脫氧葡萄糖處理4h后，再與探針孵育2h，進(jìn)行熒光檢測及成像；判斷：若細(xì)胞熒光強度減弱，則表明細(xì)胞總還原能力下降，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

所述探針的濃度為2～5μM。

一種利用具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針檢測多酚化合物的方法，如下：將探針加入待檢測細(xì)胞或待檢測物中，孵育2h后，進(jìn)行熒光檢測及紫外光譜檢測；判斷：若檢測出熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)或待檢測物中具有多酚化合物，若未檢測到熒光，則表明待檢測細(xì)胞內(nèi)或待檢測物中不具有多酚化合物。

所述探針的濃度為2～10μM。

檢測多酚化合物的原理為：多酚類抗氧化劑中酚羥基向探針提供氫原子使之轉(zhuǎn)化為抗磁性羥胺形式，從而使熒光恢復(fù)增強。

本發(fā)明的具有單電子結(jié)構(gòu)的自旋標(biāo)記熒光探針具有以下優(yōu)點：

1.合成路線簡單，只需一步酯化反應(yīng)即可得到產(chǎn)物。

2.反應(yīng)原料經(jīng)濟，反應(yīng)條件溫和，在室溫下攪拌24h即可。

3.所制備化合物細(xì)胞滲透性好，細(xì)胞毒性低。

4.可用于細(xì)胞內(nèi)羥基自由基、巰基自由基、細(xì)胞氧化還原環(huán)境的檢測以及多酚類抗氧化劑的抗氧化性能評價研究。

附圖說明

圖1：反應(yīng)前后探針激發(fā)、發(fā)射光譜，1、3分別為反應(yīng)前后激發(fā)光譜，2、4為反應(yīng)前后發(fā)射光譜。反應(yīng)條件：探針7.5μM，[Fe²⁺]＝100μM，DMSO 1％，[Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6，反應(yīng)30min；肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞經(jīng)魚藤酮刺激產(chǎn)生羥基自由基成像檢測(探針1μM)。a、b分別為肝癌細(xì)胞未經(jīng)魚藤酮和經(jīng)魚藤酮(1μM)預(yù)先處理30min，加入探針培養(yǎng)2h后成像；c、d為正常細(xì)胞如a、b同樣處理；e、f、g、h分別為相應(yīng)明場成像圖片。

圖2：反應(yīng)前后探針發(fā)射光譜，1、2分別為反應(yīng)前后發(fā)射光譜。反應(yīng)條件：探針5μM，苯酚20μM，谷胱甘肽5μM，過氧化氫5μM，辣根過氧化物酶0.0625U/mL，反應(yīng)時間10min；HL-60細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽自由基成像檢測(探針2μM)。a為探針單獨與細(xì)胞孵育10min；b為細(xì)胞與探針孵育后，加入苯酚10μM、過氧化氫2μM孵育10min；c為細(xì)胞預(yù)先與N-乙基馬來酰亞胺孵育10min之后加入苯酚10μM、過氧化氫2μM孵育10min；d、e、f分別為相應(yīng)明場成像圖片。

圖3：探針(2.5μM)與抗壞血酸(25μM)反應(yīng)前后熒光光譜變化。1、3為反應(yīng)前、后激發(fā)光譜；2、4為反應(yīng)前、后發(fā)射光譜。細(xì)胞成像監(jiān)測脫氧葡萄糖對細(xì)胞氧化還原環(huán)境的影響。a、肝癌細(xì)胞與4μM探針孵育2h；b、肝癌細(xì)胞經(jīng)10mM脫氧葡萄糖處理4h后再與4μM探針孵育2h；c、d為正常細(xì)胞分別如同a、b一樣處理；e、f、g、h分別為相應(yīng)的明場成像圖片。

圖4：HPLC-UV/Vis(550nm)檢測：水溶性維生素E(0,1,2,4,10,20mM)與20μM探針反應(yīng)。峰a、b保留時間15.6、19.5min。B圖為峰a、峰b的積分面積(紅色、黑色代表峰b、峰a)。C圖為自由基清除率(紅色(A₀-A_a)/A₀，黑色A_b/A₀，A₀＝A_a+A_b)；HPLC條件：流動相甲醇/0.01M醋酸銨(90/10，V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣體積20μL；柱溫25℃；色譜柱octadecyl silica(C18)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有 的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。

實施例1：自旋標(biāo)記熒光探針的合成

步驟如下：

(1)將羅丹明B(0.27mmol)和等摩爾量的4-羥基-2,2,6,6,-四甲基-哌啶氮氧自由基加入到反應(yīng)溶劑10mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(0.027mmol)(作為催化劑)，攪拌反應(yīng)20分鐘，再加入N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(0.27mmol)(作為脫水劑)，氬氣保護(hù)下室溫反應(yīng)24h。

(2)在減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加熱溫度低于50℃。

(3)以二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v)為洗脫劑，200目中性氧化鋁為固定相，進(jìn)行柱色譜分離；溶劑旋干，得紫紅色固體，即為自旋標(biāo)記熒光探針。

實施例2：細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的檢測實驗

體外羥基自由基生成方法采用經(jīng)典的Fenton體系，即過氧化氫在亞鐵離子催化([Fe²⁺]/[H₂O₂]＝1:6)下產(chǎn)生，羥基自由在乙腈中被DMSO(1％)捕獲生成相對穩(wěn)定的甲基自由基，與探針結(jié)合生成穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而導(dǎo)致熒光恢復(fù)達(dá)到檢測的目的。在羥基自由基檢測試劑中，探針的濃度為7.5μM，羥基自由基濃度為0-100μM。并且探針在DMSO存在的條件下對于羥基自由基具有良好的選擇性。細(xì)胞產(chǎn)生羥基自由基的檢測選用魚藤酮來對細(xì)胞進(jìn)行刺激，并對肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行對比研究。在細(xì)胞內(nèi)羥基自由基檢測試劑中，細(xì)胞經(jīng)魚藤酮1μM預(yù)處理30min后，孵育0.5％DMSO，加入探針濃度為1μM培養(yǎng)2h后成像。

體外和細(xì)胞內(nèi)羥基自由基檢測結(jié)果見附圖1和附圖說明。探針在反應(yīng)前后熒光強度很弱(如激發(fā)、發(fā)射光譜1、2所示)，而在與Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基(DMSO共存)反應(yīng)后熒光強度明顯增強(如激發(fā)、發(fā)射光譜3、4所示)。細(xì)胞內(nèi)羥基自由基檢測，如圖所示，肝癌細(xì)胞經(jīng)魚藤酮處理(b)相比空白(a)熒光強度明顯增強，這可能與魚藤酮抑制線粒體呼吸鏈中復(fù)合酶Ⅰ的活性，阻斷呼吸鏈電子傳遞，從而導(dǎo)致活性氧的大量產(chǎn)生有關(guān)，而進(jìn)入細(xì)胞的DMSO能夠與羥基自由基作用，從而導(dǎo)致探針熒光恢復(fù)增強，同理，正常肝細(xì)胞經(jīng)魚藤酮處理(d)較空白對照(c)熒光也相應(yīng)增強，但并沒有癌細(xì)胞那么明顯。推測魚藤酮對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞作用程度具有差異性，對癌細(xì)胞作用更明顯，該結(jié)果對差異性調(diào)控活性氧的產(chǎn)生來輔助抗癌具有一定的指導(dǎo)意義。

實施例3：細(xì)胞內(nèi)巰基自由基的檢測實驗

體外谷胱甘肽自由基的生成方法采用辣根過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下氧化苯酚生成苯氧自由基，進(jìn)而氧化谷胱甘肽生成谷胱甘肽自由基，進(jìn)而探針捕獲谷胱甘肽自由基生成相應(yīng)的熒光衍生物。在體外谷胱甘肽自由基檢測試劑中，探針5μM，與苯酚20μM、谷胱甘肽5μM、過氧化氫5μM和辣根過氧化物酶0.0625U/mL在10mM(pH 7.4)的磷酸鹽緩沖溶液中反應(yīng)10min。細(xì)胞產(chǎn)生谷胱甘肽自由基的檢測選用富含髓過氧化物酶的HL-60細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽自由基檢測試劑中，細(xì)胞與探針2μM預(yù)處理10min后，與苯酚10μM和過氧化氫2μM孵育10min后成像。細(xì)胞與N-乙基馬來酰亞胺預(yù)處理10min之后，熒光明顯受到抑制，證實谷胱甘肽自由基的存在。

體外和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽自由基檢測結(jié)果見附圖2和附圖說明。探針在反應(yīng)前后熒光強度很弱(如發(fā)射光譜1所示)，而在與辣根過氧化物酶催化體系產(chǎn)生的谷胱甘肽自由基作用后熒光強度明顯增強(如發(fā)射光譜2所示)。HL-60細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽自由基檢測，如圖所示，單獨探針(a)與HL-60細(xì)胞孵育后并無明顯熒光，而將苯酚和過氧化氫同時加入細(xì)胞中孵育后(b)熒光明顯增強，相反，加入巰基捕獲劑N-乙基馬來酰亞胺處理后，熒光明顯得到抑制，該探針能夠成功檢測細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽自由基，并阻斷細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽清除活性氧自由基產(chǎn)生的二級有害谷胱甘肽自由基進(jìn)一步氧化細(xì)胞內(nèi)重要活性分子。

實施例4：細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的檢測實驗

脫氧葡萄糖是葡萄糖抑制劑，減少還原性物質(zhì)NADPH以及丙酮酸等的產(chǎn)生，使細(xì)胞處于氧化狀態(tài)，采用探針熒光成像的方法對脫氧葡萄糖引起的肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞氧化還原環(huán)境的變化進(jìn)行監(jiān)測。在細(xì)胞氧化還原環(huán)境檢測試劑中，加入10mM脫氧葡萄糖處理細(xì)胞4h后再與2μM探針孵育2h。

細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的檢測結(jié)果見附圖3和附圖說明。探針在反應(yīng)前，熒光強度很弱(如1、2激發(fā)、發(fā)射光譜所示)，而經(jīng)還原性物質(zhì)(抗壞血酸)還原后，熒光強度明顯增強(如3、4激發(fā)發(fā)射光譜所示)，以上結(jié)果充分說明探針對生物還原性物質(zhì)的響應(yīng)。進(jìn)肝癌細(xì)胞一步探針對于細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境監(jiān)測，如圖所示，肝癌細(xì)胞經(jīng)10mM脫氧葡萄糖處理(b)與未經(jīng)脫氧葡萄糖處理(a)相比，熒光強度明顯減弱，證實脫氧葡萄糖抑制肝癌細(xì)胞中葡萄糖代謝，使其葡萄糖代謝產(chǎn)生的一系列還原性物質(zhì)減少，進(jìn)而細(xì)胞總還原能力下降，探針由于還原導(dǎo)致的熒光恢復(fù)減弱。與肝癌細(xì)胞不同的是，正常肝細(xì)胞經(jīng)10mM脫氧葡萄糖處理后(d)與未經(jīng)處理(c)相比，并沒有明顯的熒光強度變化。結(jié)果表明，脫氧葡萄糖對肝癌細(xì)胞氧化還原環(huán)境影響明顯而對正常肝細(xì)胞影響較弱。該方法在生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景，可以用于監(jiān)控選擇性調(diào)控癌細(xì)胞氧化還原環(huán)境而 對正常細(xì)胞影響小的藥物，如脫氧葡萄糖等的抗癌輔助治療效果，即通過藥物作用過程中細(xì)胞氧化還原環(huán)境的變化實現(xiàn)實時監(jiān)控。

實施例5：探針針對多酚類化合物的抗氧化性能研究

多酚類抗氧化劑中酚羥基向探針提供氫原子使之轉(zhuǎn)化為抗磁性羥胺形式，從而使熒光恢復(fù)增強。在色譜級甲醇溶液中，10μM探針與0-20mM水溶性維生素E室溫下反應(yīng)2h后，進(jìn)行熒光和紫外光譜檢測。為進(jìn)一步對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)，采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)，通過色譜峰面積來考察不同濃度水溶性維生素E與探針反應(yīng)時的自由基清除率，根據(jù)計算公式：A_b/(A_a+A_b)得到甲醇體系中，水溶性維生素E、槲皮素、兒茶素、木犀草素的抗氧化能力次序。

多酚類化合物的抗氧化性能研究結(jié)果見附圖4和附圖說明。通過色譜峰積分面積來考察不同濃度水溶性維生素E與探針反應(yīng)時的自由基清除率。如圖所示，隨著濃度增加，探針與水溶性維生素E反應(yīng)產(chǎn)物峰面積b逐漸增大，而峰a探針峰面積逐漸減小。圖B也表明峰a和峰b的峰面積也分別呈減小和增加的趨勢，并且兩者呈互補的關(guān)系。在同一波長處分別從探針反應(yīng)物與產(chǎn)物兩方面來檢測清除率，且由兩者所得結(jié)果具有高度吻合的特點(圖C),可作為相互印證，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。這種方法對于具有相似結(jié)構(gòu)的多酚類抗氧化性能具有較好的選擇區(qū)分性，可用于天然抗氧化劑的修飾和優(yōu)化篩選過程以及食品或飲料清除自由基抗氧化性能研究。

上述雖然結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。