本發(fā)明涉及ERG致癌蛋白的小分子抑制劑和所述化合物作為用于治療包括前列腺癌(CaP)的ERG陽性癌癥的候選治療劑的用途。CaP是最常診斷的非皮膚惡性腫瘤，并且是西方國家男性之中癌癥相關死亡的第二主要病因。盡管由于PSA篩選而被早期檢測的CaP通過手術或放射得以有效管理，但一子組相當數(shù)量的CaP患者(20％至40％)在確定性治療之后經(jīng)受疾病復發(fā)，并且將需要激素去除療法。盡管初始對療法起響應，但轉(zhuǎn)移性CaP腫瘤最終變得為激素去除療法所難治。對于這個子組的患者，即患有轉(zhuǎn)移性激素難治性癌癥的那些，不存在有效良藥。

ERG原致癌基因?qū)儆谑钦曰虮磉_調(diào)控子與負性基因表達調(diào)控子兩者的ETS轉(zhuǎn)錄因子的大家族(Watson等,2010)。這些轉(zhuǎn)錄因子是細胞增殖、細胞分化、發(fā)育、轉(zhuǎn)化、凋亡和免疫調(diào)控中涉及的促有絲分裂信號轉(zhuǎn)導路徑的下游效應物(Watson等,2010；Sreenath等,2011)。ERG基因是前列腺癌中最普遍并得以驗證的基因組改變。復發(fā)性TMPRSS2-ERG基因融合存在于西方國家所有CaP患者的幾乎一半中。這個基因融合導致截短ERG蛋白(缺失32個氨基末端殘基)的雄性激素依賴性和腫瘤細胞特異性表達。因此，ERG改變和ERG蛋白過度表達牽涉于CaP的顯現(xiàn)和進展中。

CaP中的ERG表達是AR依賴性的。盡管有許多雄激素受體(AR)信號傳導抑制劑已用作用于治療CaP的治療劑，但本發(fā)明者先前未獲悉可選擇性抑制ERG表達的化合物。因此，本發(fā)明描述選擇性抑制ERG表達的小有機分子。

發(fā)明概述

本發(fā)明描述ERG致癌蛋白的選擇性抑制劑和所述抑制劑作為用于治療ERG陽性癌癥的治療劑的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于通過向患者單獨或與其它療法組合施用治療有效量的ERG表達抑制劑來治療或預防所述患者的與野生型ERG蛋白、改變的ERG蛋白的過度表達；ERG基因轉(zhuǎn)錄增加或ERG mRNA翻譯增加相關的癌癥的方法。依據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案，抑制劑選擇性抑制ERG mRNA基因轉(zhuǎn)錄或ERG mRNA翻譯。根據(jù)本發(fā)明方法的另一實施方案，抑制劑選擇性抑制野生型ERG蛋白或改變的ERG蛋白的過度表達或ERG陽性腫瘤細胞的生長。

根據(jù)本發(fā)明方法使用的ERG抑制劑選擇性抑制ERG蛋白表達。ERG表達的示例性小分子化合物是選自由以下組成的組的那些：

或它們的藥學上可接受的鹽。

根據(jù)一個實施方案，任選與本文所述的任何其它實施方案組合，治療是通過施用以下說明為ERG蛋白過度表達的抑制劑的小分子1-(噻唑-2-基二氮烯基)萘-2-醇來實現(xiàn)。

使用一種或多種以上描述的ERG蛋白過度表達的抑制劑的本發(fā)明方法學可用于治療癌癥，尤其是選自由以下組成的組的ERG陽性癌癥：前列腺癌、結腸直腸癌、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、血管腫瘤和白血病。依據(jù)一個實施方案，任選與本文所述的任何其它實施方案組合，本發(fā)明方法用于治療被診斷有前列腺癌的患者。

本發(fā)明也提供ERG致癌蛋白表達的抑制劑和所述化合物用于治療或預防與ERG致癌蛋白過度表達相關的癌癥的用途。也提供ERG表達抑制劑制造用于治療或預防與ERG致癌蛋白過度表達相關的癌癥的藥劑的用途。

在一些實施方案中，任選與本文所述的任何其它實施方案組合，本發(fā)明提供一種用于治療或預防罹患與野生型ERG蛋白、改變的ERG蛋白的過度表達；ERG基因轉(zhuǎn)錄增加或ERG mRNA翻譯增加相關的癌癥的患者的所述癌癥的ERG表達抑制劑。受試者中其中ERG基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯可增加的過程包括但不限于基因融合、突變、復制或其它機理。在一個實施方案中，ERG表達抑制劑抑制ERG陽性腫瘤細胞的生長。

在其它實施方案中，任選與本文所述的任何其它實施方案組合，本發(fā)明提供ERG表達抑制劑用于治療或預防罹患與野生型ERG蛋白、改變的ERG蛋白的過度表達；ERG基因轉(zhuǎn)錄增加或ERG mRNA翻譯增加相關的癌癥的患者的所述癌癥的用途。

仍然在其它實施方案中，任選與本文所述的任何其它實施方案組合，本發(fā)明提供ERG表達抑制劑制造用于治療或預防罹患與野生型ERG蛋白、改變的ERG蛋白的過度表達；ERG基因轉(zhuǎn)錄增加或ERG mRNA翻譯增加相關的癌癥的患者的所述癌癥的藥劑的用途。在一個實施方案中，ERG致癌蛋白抑制劑抑制ERG陽性腫瘤細胞的生長。

附圖簡述

圖1說明由ERGi-USU(139021)和NCS-66929對VCaP細胞中ERG、AR和PSA蛋白水平的抑制。

圖2說明ERGi-USU對ERG陽性和ERG陰性CaP細胞中AR表達的影響。

圖3說明ERGi-USU對ERG陽性腫瘤細胞系和正常內(nèi)皮細胞中ERG蛋白表達的影響。

圖4說明由小分子ERGi-USU達成的對ERG陽性腫瘤細胞系的生長相對于對ERG陰性腫瘤細胞或正常細胞的生長的選擇性抑制。

圖5說明(A)由ERGi-USU的類似物對ERG表達的抑制；和(B)ERGi-USU類似物的細胞生長抑制活性。

圖6.(A)是顯示對ERG陽性腫瘤生長異種移植模型的抑制的圖。對照動物(頂部曲線)在整個研究中展現(xiàn)最大腫瘤體積，而接受最高劑量的EGi-USU的小鼠(底部曲線)展現(xiàn)最小體積。(B)是從對照動物(0mg/kg)收集的異種移植腫瘤的照片。(C)是從接受100mg/kg的動物收集的異種移植腫瘤的照片(D)是從接受150mg/kg的動物收集的異種移植腫瘤的照片。

具體實施方式

定義

“藥學上可接受的鹽”是本發(fā)明化合物的藥學上可接受的有機或無機酸或堿鹽。代表性藥學上可接受的鹽包括例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、水溶性和水不溶性鹽，諸如乙酸鹽、氨芪磺酸鹽(amsonate)(4,4-二氨基均二苯乙烯-2,2-二磺酸鹽)、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、鈣鹽、依地酸鈣鹽(calcium edetate)、右旋樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、克拉維酸鹽(clavulariate)、二鹽酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、對羥乙酰氨基苯胂酸鹽、六氟磷酸鹽、己基間苯二酚鹽、海卓胺鹽(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、異硫代硫酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、N-甲基葡糖胺銨鹽、3-羥基-2-萘甲酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽(1,1-亞甲基-雙-2-羥基-3-萘甲酸鹽，恩波酸鹽(einbonate))、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、苦味酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、對甲苯磺酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式乙酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、磺基水楊酸鹽、蘇拉明酸鹽(suramate)、丹寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、甲苯磺酸鹽、三乙基碘化物和戊酸鹽。藥學上可接受的鹽在它的結構中可具有超過一個帶電荷原子。在這個情況下，藥學上可接受的鹽可具有多個相對離子。因此，藥學上可接受的鹽可具有一個或多個帶電荷原子和/或一個或多個相對離子。

術語“治療(treat/treating/treatment)”是指改善或根除疾病或與疾病相關的癥狀。在某些實施方案中，所述術語是指由向患有所述疾病的患者施用一種或多種防治劑或治療劑所致的使疾病的擴散或惡化減至最小程度。

術語“預防(prevent/preventing/prevention)”是指由施用防治劑或治療劑所致的對患者的疾病的發(fā)作、復發(fā)或擴散的預防。

術語“有效量”是指本發(fā)明化合物或其它活性成分的足以在治療或預防疾病方面提供治療或防治益處，或足以使與疾病相關的癥狀延遲或最小化的量。此外，關于本發(fā)明化合物的治療有效量意指單獨或與其它療法組合的治療劑的在治療或預防疾病方面提供治療益處的那個量。與本發(fā)明化合物關聯(lián)使用，所述術語可涵蓋改進總體療法，減輕或避免疾病的癥狀或病因，或增強另一治療劑的治療功效或與另一治療劑協(xié)同的量。

“患者”包括動物，諸如人、母牛、馬、綿羊、羔羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗，小鼠、大鼠、兔或豚鼠。動物可為哺乳動物，諸如非靈長類動物和靈長類動物(例如猴和人)。在一個實施方案中，患者是人，諸如嬰兒、兒童、青少年或成人。

化合物和方法

本發(fā)明涉及選擇性ERG抑制劑化合物和用于使用化合物治療或預防患者的與ETS相關基因(ERG)、野生型ERG蛋白或改變的ERG蛋白的過度表達相關的癌癥的方法學。更具體來說，本發(fā)明的ERG抑制劑可不減弱或抑制測試的大多數(shù)AR陽性CaP細胞系中的雄激素受體(AR)信號傳導，并且因此當相較于抑制AR信號傳導作為用于治療前列腺癌的潛伏機理的治療劑時展現(xiàn)較少毒性副作用。另外，本發(fā)明的ERG抑制劑抑制不表達AR的腫瘤細胞系中的ERG蛋白。

為鑒定ERG特異性小分子抑制劑，本發(fā)明者通過使TMPRSS2-ERG融合陽性前列腺癌(VCaP)細胞系與小分子文庫中的固定濃度的各化合物接觸來篩選小分子化合物的文庫。利用高度特異性ERG單克隆抗體(CPDR ERG-mAb；9FY)進行檢測，使用細胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡測定(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)監(jiān)測ERG蛋白表達。參見Furusato等,Prostate Cancer Prostatic Dis.,13:228-372(2010)；Mohamed等,J.Cancer,1:197-208,(2010)；Miettinen等,Am.J.Surg Pathol.,35:432-41(2011)；以及美國專利公布號2012/0135018A1。

這個初步篩選鑒定一子組小分子抑制劑，其分別通過定量RT-PCR和western印跡對它們抑制ERG mRNA和蛋白質(zhì)的表達的能力進行分析來進一步評估?；趯RG mRNA和蛋白質(zhì)表達的一致抑制，選擇兩種小分子NSC139021(ERGi-USU)和NSC99629用于進一步生物化學和細胞生長抑制研究。

核準用于治療前列腺癌的策略慣常必須伴有減弱或抑制前列腺癌細胞中AR活性的治療劑。因為ERG在VCaP前列腺癌細胞中的表達受AR調(diào)控，所以本發(fā)明者繼續(xù)評估觀察到的ERG抑制活性是否是由ERGi-USU和NSC99629抑制AR的結果。如圖1中所說明以及以下進一步所述，ERGi-USU而非NSC99629抑制VCaP前列腺癌細胞中AR和前列腺特異性抗原(PSA)的表達。

為探究ERGi-USU是否是選擇性ERG蛋白表達抑制劑，進一步測試化合物抑制以下AR陽性/ERG陰性前列腺癌細胞系：LNCaP和MDA PCa2b(突變AR陽性和ERG陰性)中以及是AR(野生型)陽性和ERG陰性的LAPC4細胞中AR和PSA活性的能力。

如由凝膠電泳分析所說明(參見圖2)以及以下進一步所述，由ERGi-USU抑制AR是VCaP細胞特異性的。在用于這個篩選中的其它Ar陽性/ERG陰性細胞系中未觀察到AR抑制。

在一個實施方案中，本發(fā)明因此提供一種用于通過向患者施用治療有效量的ERG表達抑制劑來治療或預防所述患者的與E26相關基因(ERG)的野生型ERG蛋白或改變的ERG蛋白產(chǎn)物的過度表達相關的癌癥的方法。本發(fā)明抑制劑選擇性抑制ERG表達。盡管ERG表達被降低或抑制所采用的確切機理是未知的，但本發(fā)明化合物可影響ERG mRNA基因轉(zhuǎn)錄、ERG mRNA翻譯，阻止ERG蛋白獲得它的功能活性三級結構，或通過改變?yōu)榧毎L所必需的基因的調(diào)控來抑制ERG陽性腫瘤的生長。

由本發(fā)明者進行的研究指示ERGi-USU選擇性抑制癌細胞中的ERG表達，而不抑制正常內(nèi)皮細胞中的ERG表達。如圖3中所說明，ERGi-USU以劑量依賴性方式抑制ERG陽性癌細胞系中的ERG表達。然而，在正常HUVEC細胞中未觀察到可測量的ERG蛋白表達抑制。

據(jù)信癌細胞中的ERG過度表達在致癌基因成癮性的顯現(xiàn)方面起作用，所述致癌基因成癮性是其中一些ERG陽性癌細胞依賴于ERG蛋白的活性來達成它們的生長和存活的狀況。因此，抑制或減弱ERG陽性癌細胞中的ERG蛋白表達可阻滯癌細胞的生長和存活。如由細胞生長抑制研究的結果所說明(參見圖4)，抑制ERG表達會阻止ERG陽性癌細胞的生長。然而，對于ERG陰性前列腺癌細胞系、ERG陰性永生化良性前列腺細胞系(BPH1)，以及對于ERG陽性正常細胞，未觀察到細胞生長抑制作用。這些結果支持ERGi-USU用作用于選擇性治療諸如前列腺癌的ERG陽性癌癥的候選治療劑。因此，用于使用小分子ERGi-USU治療ERG陽性癌癥的方法提供一種用于治療對用減弱或抑制AR活性和/或去除激素活性的藥劑進行的治療不起響應的轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌的新型方法。本發(fā)明的ERG過度表達抑制劑也與一種或多種能夠治療癌癥的其它治療劑組合使用。根據(jù)這個組合治療方案的一個方面，本發(fā)明的ERG過度表達抑制劑與用于治療前列腺癌的已知AR活性抑制劑組合使用，特別是用于被診斷有其中AR活性被增大或超活化的前列腺癌的患者。

本發(fā)明的一些實施方案提供也選擇性抑制ERG陽性癌細胞中的ERG蛋白表達，分別標識為ED-1、ED-2和ED-3的額外化合物。

各化合物被進一步評估為用于治療患有ERG陽性癌癥的患者的候選治療劑。ERG陽性VCaP前列腺癌細胞和ERG陰性LNCaP細胞的單獨培養(yǎng)物用于測試各化合物的選擇性ERG表達抑制和細胞生長抑制活性。如以下進一步所述以及由圖5A和5B所說明，ED-1、ED-2和ED-3是ERG陽性癌細胞的ERG表達和生長的選擇性抑制劑。

以上觀察結果和ERG在癌細胞生長方面的作用支持ERG特異性抑制劑用作用于治療諸如前列腺癌、結腸直腸癌、尤因肉瘤、血管腫瘤和白血病的癌癥的治療劑。在一個實施方案中，接受根據(jù)本發(fā)明的方法進行的癌癥治療的受試者是哺乳動物。舉例來說，本文所述的方法和用途適于治療人的癌癥。或者，本發(fā)明的方法和用途可適于獸醫(yī)學情形下，其中受試者包括但不限于狗、貓、馬和母牛。

在本發(fā)明的所選實施方案中，ERG抑制劑是與至少一種抗癌治療劑共同施用。如本文所用，“共同施用”指示至少兩種組分各自在某一時限期間施用，其中生物活性或作用的相應時期重疊。因此，術語共同施用包括依序以及同延(coextensive)施用本發(fā)明的個別組分。因此，根據(jù)一些本發(fā)明方法“施用”組分的組合包括依序以及同延施用本發(fā)明的個別組分。同樣，短語“化合物的組合”或“組分的組合”等指示共同施用個別組分，并且這些短語未必意指化合物必須同時或同延施用。此外，施用個別組分的途徑無需相同。在一個實施方案中，本發(fā)明的組分以同一組合物形式施用。

在特定實施方案中，本發(fā)明的至少一種ERG抑制劑可與前列腺癌療法共同施用。在更特定實施方案中，ERG抑制劑與一種或多種促黃體生成激素釋放激素(LHRH)類似物，諸如但不限于亮丙瑞林(leuprolide)戈舍瑞林(goserelin)曲普瑞林(triptorelin)地加瑞克(degarelix)阿比特龍(Abiraterone)和組胺瑞林(histrelin)共同施用。在其它特定實施方案中，ERG抑制劑與一種或多種抗雄激素受體，諸如但不限于氟他胺(flutamide)比卡魯胺(bicalutamide)恩雜魯胺(Enzalutamide)和尼魯米特(nilutamide)共同施用。在其它特定實施方案中，ERG抑制劑與一種或多種化學治療劑，諸如但不限于多西他賽(Docetaxel)卡巴他賽(Cabazitaxel)米托蒽醌(Mitoxantrone)雌氮芥(Estramustine)多柔比星(Doxorubicin)依托泊苷(Etoposide)(VP-16)、長春花堿(Vinblastine)太平洋紫杉醇(Paclitaxel)卡鉑(Carboplatin)和長春瑞濱(Vinorelbine)共同施用。

在一個實施方案中，ERG抑制劑作為第一線療法施用。在其它實施方案中，ERG抑制劑作為第二線療法或第三線療法施用。在其它實施方案中，ERG抑制劑遲于第三線療法施用。如本文所用，第一線療法是在診斷有充分理由使用ERG抑制劑的病狀(諸如但不限于前列腺癌)后首先指定或遵循的治療方案。第二線療法是在診斷有充分理由使用ERG抑制劑的病狀(諸如但不限于前列腺癌)的復發(fā)或轉(zhuǎn)移后指定或遵循的治療方案。同樣，第三線療法是在診斷有充分理由使用ERG抑制劑的病狀(諸如但不限于前列腺癌)的第二復發(fā)或轉(zhuǎn)移后指定或遵循的治療方案。出于確定如本文所用的任一“線”療法的目的，療法無需是藥物療法。舉例來說，如本文所用的第一線療法可為手術移除或放射療法。被設計以移除、減輕或切除腫瘤或病狀的任何療法都可被視為某一“線”療法。

在其它實施方案中，ERG抑制劑可在本文中作為“維持”治療施用。如本文所用，維持治療是當受試者無任何需要治療的可檢測病狀時，例如在從受試者手術移除腫瘤之后指定或遵循的治療方案。在這些實施方案中，ERG抑制劑可例如在手術切除之后持續(xù)指定時期加以采用，諸如但不限于在腫瘤或癌移除或消散之后至少約6個月、1年、2年、3年、4年或5年。

藥物制劑、施用途徑和給藥方案

盡管存在通常將ERG表達與癌細胞生長相關聯(lián)的證據(jù)，但本發(fā)明者未獲悉選擇性抑制癌細胞中的ERG表達的任何化合物或選擇性ERG抑制劑作為抗贅生劑的用途。本發(fā)明提供適用于治療罹患ERG陽性癌癥的受試者的化合物和它們的藥物組合物，如以上更一般地所闡述。

本發(fā)明的化合物或組合物可如上文所述加以配制，并且適于以治療有效量以許多方式向受試者施用。如本文所述的化合物的治療有效量取決于所用賦形劑的量和類型、呈某一劑型的活性成分的量和特定類型、以及向患者施用化合物所將采用的途徑。然而，本發(fā)明的典型劑型包含化合物或所述化合物的藥學上可接受的鹽。

本發(fā)明化合物的典型劑量水平通常在每天每kg患者體重約0.001至約100mg的范圍內(nèi)，其可以單次劑量或多次劑量施用。一示例性劑量是每天約0.01至約25mg/kg或每天約0.05至約10mg/kg。在其它實施方案中，劑量水平是每天約0.01至約25mg/kg、每天約0.05至約10mg/kg、或每天約0.1至約5mg/kg。

劑量可通常在每天約0.1mg至約2000mg的范圍內(nèi)，以1天1次單次劑量形式，或替代地，以全天分次劑量形式給與，任選與食物一起采用。在一個實施方案中，每日劑量是以相等分次劑量每日兩次施用。每日劑量范圍可為每天約5mg至約500mg，諸如像在每天約10mg與約300mg之間。在管理患者時，療法可在較低劑量，或許約1mg至約25mg下啟始，并且必要時增加直至每天約200mg至約2000mg，視患者的整體響應而定以單次劑量或分次劑量形式。

本發(fā)明的ERG抑制劑化合物可通過口服、胃腸外(例如肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、ICV、腦池內(nèi)注射或輸注、皮下注射或植入)、吸入、經(jīng)鼻、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、舌下或經(jīng)表面(例如經(jīng)皮、局部)施用途徑來施用。可將抑制劑單獨或一起配制成含有適于各施用途徑的常規(guī)無毒藥學上可接受的載體、佐劑和媒介物的適合劑量單位制劑。

舉例來說，本發(fā)明的適合口服組合物包括不限于片劑、錠劑、糖錠、水性或油性混懸液、可分散粉劑或顆粒劑、乳液、硬質(zhì)或軟質(zhì)膠囊、糖漿或酏劑。可根據(jù)為本領域所知用于制造藥物組合物的任何方法制備適于口服使用的本發(fā)明組合物。舉例來說，本發(fā)明化合物的液體制劑可含有一種或多種選自由甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑組成的組的試劑以提供ERG抑制劑的藥學上雅致和適口的制劑。

對于片劑組合物，典型無毒藥學上可接受的賦形劑包括不限于惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化劑和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠；或潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可為未包覆的，或它們可通過已知包覆技術包覆以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，并且由此提供歷經(jīng)所需時期的持續(xù)治療作用。舉例來說，可采用延時物質(zhì)，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

供口服使用的制劑也可呈現(xiàn)為硬質(zhì)明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或呈現(xiàn)為軟質(zhì)明膠膠囊，其中活性成分與水或油介質(zhì)，例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。

對于水性混懸液，使本發(fā)明化合物與適于維持穩(wěn)定混懸液的賦形劑摻混。所述賦形劑的實例包括不限于羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠。

口服混懸液也可含有分散劑或濕潤劑，諸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、或氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如聚氧化乙烯硬脂酸酯)、或氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物(例如十七乙烯氧基鯨蠟醇)、或氧化乙烯與由脂肪酸和己糖醇獲得的偏酯的縮合產(chǎn)物(諸如聚氧化乙烯山梨糖醇單油酸酯)、或氧化乙烯與由脂肪酸和己糖醇酐獲得的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性混懸液也可含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯)、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑和一種或多種甜味劑(諸如蔗糖或糖精)。

可添加甜味劑(諸如以上闡述的那些)和調(diào)味劑以提供適口的口服制劑。這些組合物可通過添加諸如抗壞血酸的抗氧化劑來防腐。

適于通過添加水來設備水性混懸液的可分散粉劑和顆粒劑可提供與分散劑或濕潤劑、混懸劑和一種或多種防腐劑摻混的活性成分。適合分散劑或濕潤劑以及混懸劑由以上已提及的那些例示。也可存在額外賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。

糖漿和酏劑可用例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖的甜味劑配制。所述制劑也可含有緩和劑、防腐劑以及調(diào)味劑和著色劑。

于適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或鞘內(nèi)遞送的無菌介質(zhì)中配制用于胃腸外施用的組合物。本發(fā)明化合物的無菌可注射制劑可呈無菌可注射溶液或無菌可注射混懸液形式。例如1,3-丁二醇的無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑可用于配制胃腸外組合物。.在可采用的可接受的媒介物和溶劑之中的是水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等張氯化鈉溶液。此外，無菌油也可用作溶劑或混懸介質(zhì)。出于這個目的，可采用任何溫和不揮發(fā)性油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。此外，諸如油酸的脂肪酸可用于制備可注射劑。

視所用媒介物以及藥物在制劑中的濃度而定，胃腸外制劑可含有其它佐劑，諸如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑。

實施例

細胞系：

腫瘤細胞系VCaP、COLO320、KG-1、MOLT4、LNCaP和MDA Pca2b從美國組織培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC；Manassas,VA)獲得。使細胞在ATCC推薦的細胞培養(yǎng)基中在如由供應商推薦的細胞生長促進條件下生長。也從ATCC獲得正常細胞，諸如人臍靜脈內(nèi)皮細胞的HUVEC原代培養(yǎng)物和由用人乳頭狀瘤病毒18永生化的正常成人前列腺上皮細胞產(chǎn)生的RWPE1細胞系。源于用SV40大T抗原永生化的原代上皮細胞培養(yǎng)物的BPH1細胞系由Simon Hayward博士(Vanderbilt University Medical Center)惠贈。作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞系的LAPC4由Charles Sawyer博士(那時在UCLA)惠贈。

試劑：

在前列腺疾病研究中心(Center for Prostate Disease Research)開發(fā)并表征ERG單克隆抗體(CPDR ERG-MAb；9FY)。針對雄激素受體(AR；sc-816)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH；sc-25778)和α-微管蛋白(sc-5286)的抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。針對前列腺特異性抗原的抗體(PSA；A0562012)從DakoCytomation(Carpinteria,CA)獲得。針對凋亡(9915S)和細胞周期調(diào)控子(9932)的抗體進樣器試劑盒購自Cell Signaling(Danvers,MA)。綿羊抗小鼠IgG-HRP(NXA931)和驢抗兔IgG-HRP(NXA934V)從GE Health Care,Buckinghamshire,UK獲得。小分子文庫從美國國立癌癥研究所(National Cancer Institute)的發(fā)展治療劑計劃(Developmental Therapeutics Program，DTP)獲得。

用于篩選ERG致癌蛋白表達的抑制劑的一般性方案：

TMPRSS2-ERG融合陽性前列腺癌細胞系VCaP(ATCC)用于鑒定ERG表達的小分子抑制劑。用適當劑量的測試化合物處理VCaP細胞48小時。如以下進一步所述，使用ERG特異性CPDR ERG-MAb，通過細胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡測定(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)來評估對ERG表達的抑制。

選擇ERG siRNA作為陽性對照

針對人ERG基因(基因標識符：2078；登記號：NM_004449)的小干擾RNA(siRNA)寡聚雙鏈體(5’CGA CAU CCU UCU CUC ACA UAU 3’：si-1；和5’UGA UGU UGA UAA AGC CUU A 3’：si-2)購自Dharmacon(Lafayette,CO)，并且作為用于ERG表達抑制篩選中的陽性對照加以評估。兩種siRNA被選擇來主要排除脫靶或非特異性作用。因為兩種siRNA均顯示相同結果，所以si-1用于下述ERG表達抑制研究中。非靶向性(NT)siRNA雙鏈體用作陰性對照(D-001206-13-20；Dharmacon,Lafayette,CO)。將細胞在它們的相應生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，隨后使用50nM濃度的NT siRNA或ERG siRNA進行轉(zhuǎn)染。Lipofectamine(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于轉(zhuǎn)染。

用于通過蛋白質(zhì)印跡分析來評估測試化合物的抑制作用的一般性方案：

用各測試ERG抑制劑在特定劑量下處理培養(yǎng)的細胞。在持續(xù)指示時期孵育處理的細胞之后，使用含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物I和III(Sigma,St Louis,MO)的哺乳動物蛋白質(zhì)提取試劑(M-PER；Pierce,Rockford,IL)使細胞裂解。使含有50μg總蛋白質(zhì)的細胞裂解物通過4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行電泳，并且將細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使膜與針對AR、PSA、GAPDH、α-微管蛋白、凋亡標志物和細胞周期調(diào)控子的初級抗體一起在4℃下孵育12小時。在暴露于初級抗體之后，將膜用緩沖液洗滌(三次，各次5分鐘，在室溫下)，隨后與相關二級抗體一起在24℃下孵育1小時。最后，將膜用緩沖液洗滌，并且使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑(GE Health Care,Buckinghamshire,UK)顯色。

用于細胞生長和腫瘤生長抑制研究的一般性方案：

使用如由供應商建議的適當生長培養(yǎng)基，使適當ERG陽性癌細胞、對照ERG陰性細胞或ERG陽性正常細胞在組織培養(yǎng)皿中以粘著單層或懸浮物形式生長。在接種細胞之后48小時，在預定濃度下添加適當測試化合物至組織培養(yǎng)皿的各孔中。每24小時用含有相同濃度的相同測試化合物的新鮮生長培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基，持續(xù)細胞生長抑制測定的指示時期。使用用于估計組織培養(yǎng)皿的各測試孔中的細胞密度的血球計以及用以估計各測試孔中的活細胞分數(shù)的臺盼藍染料排斥顯微術和攝影術計算細胞生長抑制百分比。

6-8周齡以及稱重27至30g的雄性無胸腺裸小鼠購自Charles River Laboratories。用胰蛋白酶處理具有ERG的前列腺癌細胞(VCaP)并用冰冷PBS洗滌兩次，并且再混懸于無血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)的冰冷50％基質(zhì)膠中。將總計4×10⁶個細胞/0.1ml/小鼠皮下注射至小鼠的右下背側(cè)側(cè)腹中。在注射之前，用吸入麻醉法(異氟烷)使小鼠麻醉。在注射之后每周監(jiān)測腫瘤生長。3周后(此時腫瘤可觸知)，將小鼠隨機分成2個實驗組和1個對照組，各組中有7只小鼠。在治療組中，用100mg/kg的ERGi-USU或150mg/kg的ERGi-USU腹膜內(nèi)(I.P)注射小鼠，而對照組僅用媒介物(1:1[v/v]，DMSO/PEG300)注射。通過數(shù)字測徑規(guī)測量來每周記錄腫瘤體積生長，并且使用1/2(L×W²)公式計算腫瘤體積，其中L＝腫瘤的長度，并且W＝寬度。在重復測量下比較治療組與對照組之間的腫瘤體積，并且使用史都登氏t檢驗(students t-test)計算各組之間結果的統(tǒng)計顯著性并計算p值。

實施例1：鑒定ERG特異性小分子抑制劑

TMPRSS2-ERG融合陽性前列腺癌細胞系VCaP購自ATCC。使用由供應商指定的條件，使細胞在培養(yǎng)基中生長。將處于指數(shù)生長下的VCaP細胞在每孔20,000個細胞的細胞密度下接種在組織培養(yǎng)皿中。過夜后回收接種的細胞，隨后使細胞暴露于小分子文庫(發(fā)展治療劑計劃，核準的腫瘤學藥物組II、多樣性組II、機制組和天然產(chǎn)物組，美國國立癌癥研究所(NCI))中存在的各化合物和選自商業(yè)供應商Spectrum Collection的化合物的單一1μM劑量48小時的時期。

通過細胞內(nèi)蛋白質(zhì)測定(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)來測定由測試化合物對ERG表達的抑制。ERG特異性單克隆抗體CPDR ERG-MAb用作初級抗體。簡要來說，通過用多聚甲醛固定洗滌的細胞，隨后使固定的細胞可滲透化并使用初級抗體進行免疫標記來進行細胞內(nèi)蛋白質(zhì)測定。洗滌免疫標記的細胞，并且使用Sapphire700、DRAQ5和二級IRDye 800染色。

使組織培養(yǎng)板在Li-Cor Odyssey紅外成像系統(tǒng)上成像，并且測量紅外信號以提供ERG表達的值和細胞數(shù)目(經(jīng)由DNA染色)的值。對這些值進行由96孔板上孔位置所致的視差的修正。修正的ERG表達信號值和細胞數(shù)目信號值的比率用于產(chǎn)生ERG表達的通過細胞數(shù)目加以標準化的單一值以檢測低于在初級篩選期間獲得的所有標準化值的平均值>2.5標準偏差的孔。一式兩份進行篩選，并且將在兩個個別篩選中均使標準化ERG表達降低的化合物鑒定為陽性命中物。這個研究鑒定包括ERGi-USU的10種先導化合物作為ERG蛋白表達抑制劑。

實施例2：通過定量分析ERG轉(zhuǎn)錄物來確認先導化合物的ERG表達抑制活性

通過初級篩選鑒定的ERG抑制劑在定量RT-PCR測定中用于評估它們抑制ERG mRNA表達的能力。簡要來說，用10種化合物各自在1μM的濃度下處理VCaP細胞24小時。在與測試化合物一起孵育之后，裂解細胞并分離總RNA。200ng總RNA用于通過將對tERG的編碼序列具有特異性的一對ERG引物用于分析以進行qRT-PCR來分析ERG轉(zhuǎn)錄物。這個篩選鑒定以下3種測試化合物NSC139021(ERGi-USU)、NSC72292和NSC99629作為ERG-mRNA表達抑制劑。

圖1說明由NSC139021(ERGi-USU)和NSC99629對VCaP細胞中ERG蛋白表達的劑量依賴性抑制。如由圖1中的2個凝膠所示，用作陽性對照的ERG siRNA(si-1)相較于對照siRNA(非靶向性siRNA：NT)強烈抑制ERG蛋白表達。小分子ERGi-USU也以劑量依賴性方式(0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM)抑制VCaP細胞中ERG的表達，其中在1μM以及更高的劑量下觀察到較大ERG抑制水平。ERGi-USU也抑制PSA和AR蛋白的表達，特別是在大于0.5μM的劑量下。

然而，在用NSC99629處理的VCaP細胞中，未觀察到對ERG、AR或PSA表達的可觀抑制。總之，蛋白質(zhì)抑制研究證明ERGi-USU是致癌蛋白ERG的抑制劑。

實施例3：ERGi-USU是選擇性ERG表達抑制劑

使用VCaP細胞進行的ERG蛋白抑制研究(以上)已指示在這個癌細胞系中，除ERG之外，ERGi-USU也抑制AR和PSA蛋白。因為ERG在VCaP前列腺癌細胞中的表達受AR調(diào)控，所以進行使用AR陽性/ERG陰性LNCaP、MDA PCa2b和LAPC4細胞的進一步研究以確認觀察到的對VCaP細胞中ERG表達的抑制不是由ERGi-USU特異性抑制AR的結果。

簡要來說，將處于指數(shù)生長下的ERG陽性VCaP細胞以及ERG陰性LNCaP、MDA PCa2b和LAPC4細胞在每個培養(yǎng)皿2x10⁶個細胞的細胞密度下接種在10cm組織培養(yǎng)皿中。使接種的細胞與0、0.1、0.5、1.0、5.0和10μM濃度的ERGi-USU接觸48小時的時期。接著處理來自各培養(yǎng)皿的細胞以進行蛋白質(zhì)印跡分析，并且監(jiān)測ERG蛋白表達改變。

如由凝膠電泳分析所說明(參見圖2)，在0.1μM至10μM的范圍內(nèi)增加劑量的ERGi-USU不抑制以上提及的AR陽性/ERG陰性細胞系中的AR或PSA蛋白表達。然而，在VCaP細胞中，AR與PSA表達兩者均被抑制，其中在較高濃度的ERGi-USU下觀察到較大抑制。因為VCaP中的ERG表達受AR調(diào)控，所以本發(fā)明者已假設對VCaP細胞中AR與ERG的并行抑制最可能為這個前列腺癌細胞系情形所特有。

由本發(fā)明者進行的研究也已顯示ERGi-USU選擇性抑制癌細胞中的ERG表達，而不抑制正常內(nèi)皮細胞中的ERG表達。舉例來說，觀察到ERGi-USU以劑量依賴性方式抑制以下ERG陽性癌細胞系(即COLO320(結腸癌)、KG-1和MOLT4(白血病細胞系)和VCaP(前列腺癌))中的ERG表達。然而，在正常內(nèi)皮HUVEC細胞中，未觀察到對ERG表達的抑制。參見圖3。這個結果提供對小分子ERGi-USU是癌細胞中ERG表達的選擇性抑制劑的觀察結果的進一步支持。

實施例4：ERGi-USU選擇性抑制ERG陽性腫瘤的生長。

上述蛋白質(zhì)抑制研究指示ERGi-USU是選擇性ERG表達抑制劑。為探究ERGi-USU是否選擇性阻滯ERG陽性癌細胞的生長而不阻滯ERG陰性癌細胞的生長，使用以下癌細胞系和正常細胞系進行細胞生長抑制研究：ERG陽性癌細胞(VCaP、COLO320、MOLT-4和KG-1)癌細胞、ERG陰性癌細胞(LNCaP、MDA PCa2b和LAPC4)癌細胞、正常前列腺RWPE-1和BPH-1細胞和正常內(nèi)皮HUVEC細胞。培養(yǎng)各細胞系以獲得處于指數(shù)生長下的細胞，并且接著將這些細胞在每孔2×10⁶個細胞的細胞密度下接種在10cm組織培養(yǎng)皿的孔中。使接種的細胞與0、0.1、0.5、1.0、5.0和10μM濃度的ERGi-USU接觸2、4、6和8天的時期。在各時期結束時，從測試板回收細胞，洗滌，并且使用血球計和臺盼藍染料染色方法測定細胞密度和活力。將細胞生長抑制表示為使細胞數(shù)目關聯(lián)于ERGi-USU的濃度的圖。

圖4說明用于計算ERGi-USU的為抑制以上提及的細胞的生長的50％所需的濃度(IC₅₀)的細胞生長抑制研究的結果。如由這個圖所說明，ERGi-USU是培養(yǎng)的ERG陽性癌細胞的生長的有效抑制劑。相比之下，ERGi-USU對ERG陰性癌細胞、正常前列腺細胞和正常內(nèi)皮細胞的生長顯示最小抑制作用。

表1概述ERGi-USU對源于腫瘤或正常組織的ERG陽性細胞和ERG陰性細胞的細胞生長抑制活性?；贗C₅₀值，ERGi-USU在低納體積摩爾濃度范圍內(nèi)抑制ERG陽性癌細胞的生長，例如IC₅₀值在50nM至300nM之間。未觀察到對ERG陰性癌細胞、ERG陰性正常細胞以及對ERG陽性正常HUVEC細胞的細胞生長抑制，即使在抑制劑濃度大于10μM下也是這樣。因為僅觀察到對ERG陽性癌細胞的細胞生長阻滯，所以表1中的結果證明ERGi-USU是用于治療ERG陽性癌癥，例如用于治療轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌的治療劑。

表1

也確定ERGi-USU的3種類似物(ED-1、ED-2和ED-3)的ERG蛋白表達抑制和細胞生長抑制活性。通過使2×10⁶個VCaP細胞與1μM和10μM濃度的適當抑制劑化合物接觸24小時，隨后使細胞裂解，并且對細胞裂解物進行凝膠電泳分析以定量ERG蛋白表達抑制百分比來評估由這些化合物達成的ERG蛋白抑制。如圖5A中所說明，ED-1、ED-2和ED-3各自抑制VCaP細胞中的ERG表達。ED-1和ED-2是比ED-3更有效力的ERG表達抑制劑。圖5A進一步說明ED-1和ED-2的抑制活性均與ERGi-USU相當。

ED-1、ED-2和ED-3也抑制培養(yǎng)的VCaP前列腺癌細胞的生長，但在1μM和10μM的劑量下不顯示對ERG陰性LNCaP細胞的生長的可測量抑制作用。參見圖5B，其中柱狀圖說明ED-1是比ED-2和ED-3更有效力的VCaP癌細胞抑制劑。然而，測試化合物都不抑制培養(yǎng)的ERG陰性LNCaP前列腺癌細胞的生長?？傊?，這些結果證明類似于ERGi-USU的ED-1、ED-2和ED-3選擇性抑制ERG陽性癌細胞中的ERG表達，并且這個ERG表達抑制最可能導致對培養(yǎng)的ERG陽性癌細胞的阻滯。因此，ERGi-USU、它的類似物ED-1、ED-2和ED-3以及它們的藥學上可接受的鹽可用作用于根據(jù)本發(fā)明方法來治療ERG陽性癌癥的治療劑。

實施例5：ERGi-USU在體內(nèi)抑制ERG陽性腫瘤的生長。

用約4X10⁶個VCaP細胞注射雄性裸小鼠，并且監(jiān)測腫瘤生長。腫瘤在注射后4至5周之間開始顯現(xiàn)，此時將小鼠隨機分入2個實驗組和1個對照組中。每周3次用150mg/kg ERGi-USU或100mg/kg ERGi-USU腹膜內(nèi)注射治療組。也每周3次用單獨媒介物注射對照動物。每周監(jiān)測腫瘤生長。圖6A顯示對照動物(頂部曲線)實際上在整個研究中展現(xiàn)最大腫瘤體積，而接受最高劑量的ERGi-USU的小鼠(底部曲線)展現(xiàn)最小體積。