本發(fā)明提供了一個(gè)可用于選擇性檢測(cè)硝基還原酶的熒光探針，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差別實(shí)現(xiàn)對(duì)硝基還原酶活性的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

硝基還原酶可由大腸桿菌等細(xì)菌合成，在人的某些類(lèi)型的細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)也會(huì)大量表達(dá),在還原型輔酶ⅰ(nadh)或ⅱ(nadph)存在下，硝基還原酶可以代謝芳香族硝基化合物；另一方面，硝基還原酶可用于生物化工合成、抗腫瘤藥物研發(fā)等領(lǐng)域(萬(wàn)瓊瓊等，分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2014年，第30卷，755-759頁(yè))。因此，評(píng)價(jià)硝基還原酶的活性就有著十分重要的意義。

熒光法是有效檢測(cè)硝基還原酶活性的手段之一。一個(gè)有應(yīng)用價(jià)值的熒光探針需要有專(zhuān)一的選擇性。值得注意的是，在生理?xiàng)l件下，硫化氫也可能將硝基還原為氨基；利用這一反應(yīng)，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多個(gè)檢測(cè)生物體系內(nèi)硫化氫的熒光探針(fabiaoyuet.al,chem.commun.,2014,50,12234-12249)。根據(jù)我們的文獻(xiàn)調(diào)研，完全不對(duì)硫化氫響應(yīng)的檢測(cè)硝基還原酶的熒光探針還沒(méi)有報(bào)道。因此開(kāi)發(fā)對(duì)硝基還原酶具有高選擇性的熒光探針仍然具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種可用于選擇性檢測(cè)硝基還原酶的熒光探針，在生理?xiàng)l件下硫化氫不能使得體系熒光增強(qiáng)。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：采用萘酰亞胺染料作為熒光母體，基于硝基被還原為氨基引起的多米諾分解反應(yīng)，在還原型輔酶ⅰ存在下，本探針可以在ph為7.2的水溶液中選擇性地被硝基還原酶代謝，代謝產(chǎn)物可以發(fā)出強(qiáng)熒光，從而實(shí)現(xiàn)選擇性地檢測(cè)硝基還原酶。

所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式為a：

上述結(jié)構(gòu)式a表示的熒光探針應(yīng)用于檢測(cè)硝基還原酶，反應(yīng)生成具有結(jié)構(gòu)式b結(jié)構(gòu)的化合物，從而導(dǎo)致體系熒光增強(qiáng)。

結(jié)構(gòu)式a所示的熒光探針可對(duì)硝基還原酶定性、定量的檢測(cè)。將濃度呈梯度變化的硝基還 原酶分別加入含熒光探針a和還原性輔酶ⅰ的水溶液中，反應(yīng)達(dá)到平衡后，分別測(cè)定各樣品的熒光強(qiáng)度，然后以硝基還原酶的濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)后體系的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可根據(jù)熒光強(qiáng)度從圖中讀出待測(cè)溶液中硝基還原酶的含量。

本發(fā)明的有益效果：在硝基還原酶、還原性輔酶ⅰ的存在下，熒光探針a的水溶液的熒光發(fā)生顯著改變，可用于高選擇性、高靈敏性地檢測(cè)硝基還原酶含量或活性。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明提供的熒光探針檢測(cè)硝基還原酶的原理示意圖；

圖2實(shí)施例1中熒光探針a的合成流程圖；

圖3實(shí)施例2中熒光探針a對(duì)硝基還原酶響應(yīng)的吸收光譜變化示意圖；

圖4實(shí)施例2中熒光探針a水溶液的熒光光譜(a)和熒光強(qiáng)度(b)隨硝基還原酶濃度的變化示意圖；

圖5實(shí)施例3中硝基還原酶催化熒光探針a反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線；

圖6實(shí)施例4中熒光探針a的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。

實(shí)施例1(熒光探針a的合成)：

熒光探針a的合成流程如圖2所示。向250ml三口燒瓶中加入n-嗎啉乙胺基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺(0.33g，1mmol)、碳酸鉀(1.00g)、對(duì)硝基芐溴(0.43g，2mmol)，真空/氬氣置換3次后，加入150ml無(wú)水乙腈，在氬氣保護(hù)下升溫至乙腈回流，加熱攪拌4個(gè)小時(shí)。將反應(yīng)液減壓蒸發(fā)，所得固體經(jīng)柱層析純化得目標(biāo)化合物熒光探針a。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.63(d,j＝8.0hz,2h),8.54(d,j＝8.0hz,1h),8.33(d,j＝8.4hz,2h),7.78–7.72(m,3h),7.10(d,j＝8.0hz,1h),5.49(s,1h),4.34(t,j＝7.0hz,2h),3.70(t,j＝4.2hz,4h),2.73(t,j＝6.8hz,2h),2.63(s,4h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm):14.14,22.70,29.71,31.93,37.03,53.77,56.17,66.94,69.46,106.42,115.93,122.55,124.15,126.41,127.86,128.45,131.83,133.14,142.72,148.00,159.0,163.76,164.37.hrms:m/z,calcdforc25h23n3o6,[mh]⁺:462.1665,found462.1661.

實(shí)施例2(熒光探針a對(duì)硝基還原酶的吸收光譜和發(fā)射光譜響應(yīng))：

向含有5μm熒光探針a和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm，助溶劑dmso占總體積的1％)中加入不同體積的硝基還原酶溶液(1mg/ml)。在37℃下反應(yīng)60min后測(cè)量工作液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為445nm。

熒光探針a對(duì)硝基還原酶的吸收光譜和發(fā)射光譜響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖3和圖4所示。從 圖3中可以看出，隨加入的硝基還原酶量增加(從0到30μg/ml),溶液體系在445nm處的吸光度逐漸增加，出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，這個(gè)吸收峰是產(chǎn)物b貢獻(xiàn)的。圖4a表明隨加入的硝基還原酶量增加，體系熒光顯著增強(qiáng)，在550nm處出現(xiàn)的新的熒光峰是產(chǎn)物b貢獻(xiàn)的。圖4b給出了探針溶液對(duì)不同量的硝基還原酶的熒光響應(yīng)，縱坐標(biāo)表示用熒光儀檢測(cè)到的550nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示加入的硝基還原酶的含量；在硝基還原酶的含量為0-3.0μg/ml范圍內(nèi)，550nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度與加入的硝基還原酶濃度存在著線性關(guān)系(線性相關(guān)系數(shù)為0.9929)。

實(shí)施例3(硝基還原酶催化熒光探針a反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn))

向含有硝基還原酶(25μg/ml)和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm)中加入不同濃度的熒光探針a(溶液的最終dmso含量為占總體積5％)，用酶標(biāo)儀在37℃下每間隔1min測(cè)量一次溶液在550nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為445nm。

另外，在相同條件下配制含有不同已知濃度的分子b(按照文獻(xiàn)合成)的溶液，得到表示分子b在550nm處的熒光強(qiáng)度和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

硝基還原酶催化熒光探針a反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(s)，縱坐標(biāo)表示550nm處的熒光強(qiáng)度，所加入的熒光探針a的濃度為0μm,0.78μm,1.56μm,3.13μm,4.69μm,6.25μm,12.5μm,18.75μm,25μm。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)擬合michaelis-menten方程，可以得到該探針的vmax＝0.017μm/s,km＝43.7μm。

實(shí)施例4(熒光探針a對(duì)硝基還原酶的選擇性)：

向含有5μm熒光探針a和還原性輔酶ⅰ(0.5mm)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.2，10mm，助溶劑dmso占總體積的1％)中加入各種分析物。在37℃下等待60min后測(cè)量工作液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為445nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，加入還原型谷胱甘肽(1mm，5mm)、維生素c(1mm)、雙氧水(1mm)、次氯酸鈉(100μm)、二硫蘇糖醇(1mm)、高半胱氨酸(1mm)、精氨酸(1mm)、半胱氨酸(1mm)、硫化鈉(1mm，是一種硫化氫供體)、人血清白蛋白(1mg/ml)、氯化鈣(1mm)、氯化鎂(1mm)都不能使得熒光增強(qiáng)，而加入硝基還原酶(10μg/ml)后熒光增長(zhǎng)達(dá)上百倍，結(jié)果表明熒光探針a對(duì)硝基還原酶具有十分優(yōu)異的選擇性。