本發(fā)明屬于寄生蟲病防治的生物光學(xué)標(biāo)記領(lǐng)域，具體來說，本發(fā)明涉及一種近紅外有機(jī)熒光染料的合成及其應(yīng)用于血吸蟲成蟲的熒光標(biāo)記，本發(fā)明為血吸蟲成蟲熒光標(biāo)記提供了一種新穎的方法，該近紅外熒光染料對血吸蟲成蟲具有優(yōu)良的熒光標(biāo)記效果。

技術(shù)背景

血吸蟲病是一種盛行于熱帶和亞熱帶地區(qū)、對人民身體健康有嚴(yán)重危害并影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的傳染病，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為極易復(fù)現(xiàn)的再現(xiàn)傳染病。血吸蟲病流行于74個國家和地區(qū)，全世界目前約有6.52億人口受威脅，有1.93億感染者，有癥狀病例約1.2億，其中2000萬為嚴(yán)重病例，我國是血吸蟲病的主要流行區(qū)。血吸蟲病是一種典型的經(jīng)水源傳播的人獸共患寄生蟲病，其生活史可分為卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童蟲和成蟲等7個主要階段。血吸蟲尾蚴進(jìn)入人體之后，發(fā)育為童蟲階段，再通過30天左右成長為成蟲，成蟲對人體造成極大的傷害，引發(fā)肝脾腫大、肝硬化等，晚期嚴(yán)重者可以致人死亡。目前已研制出了對吸蟲成蟲有良好殺滅效果的藥物(例如吡喹酮)，但由于抗血吸蟲藥物的長期廣泛大量使用，血吸蟲已經(jīng)對其產(chǎn)生耐藥性。同時該類藥物滅殺成蟲的實際作用機(jī)理尚不明確，所以還需要對抗血吸蟲藥物進(jìn)行深入的研究。但是傳統(tǒng)的研究方法(主要為對死亡蟲體的檢測)來研究藥物對成蟲的可能作用機(jī)理，并不能準(zhǔn)確、直接地反映出藥物在活體上的作用方式和位點，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，因此需要尋求新的研究方法來探索其作用機(jī)制。目前，熒光成像是一項靈敏的、非侵入式、費用低廉的可視化檢測技術(shù)，其分辨率可達(dá)百納米，可實現(xiàn)從細(xì)胞到生物體的活體成像。熒光成像技術(shù)具有監(jiān)測靈敏、成像迅速、可同時觀測多分子事件等優(yōu)點，因此在抗血吸蟲藥物作用機(jī)理研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

熒光成像用于血吸蟲研究方面，Andrea B.Kohn等采用4,5-diaminoXuorescein-2熒光探針檢測血吸蟲體內(nèi)一氧化氮的含量，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲體一氧化氮的釋放依賴于一氧化氮合酶(NOS)，表明一氧化氮酶在血吸蟲的生理上起著重要的作用。SATO H.等應(yīng)用熒光成像的方法觀察曼氏血吸蟲成蟲的排泄系統(tǒng)。應(yīng)用熒光探針試鹵靈(resorufin)觀察蟲體排泄系統(tǒng)的作用模式，其研究結(jié)果將有助于了解曼氏血吸蟲原腎系的生理功能。

上述使用傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料作為熒光探針對血吸蟲成蟲進(jìn)行研究，存在以下的缺點：(1)短波長激發(fā)與發(fā)射存在生物自發(fā)背景熒光干擾。(2)大部分的熒光探針光穩(wěn)定性差，導(dǎo)致不能長時間熒光觀察。(3)大部分有機(jī)小分子熒光染料親水性差，限制了其生物應(yīng)用。同時，血吸蟲成蟲結(jié)構(gòu)具有以下特征：(1)血吸蟲成蟲體壁由體被、基膜及體被下層構(gòu)成，并通過胞質(zhì)小管與體被相連，使體被下層被表層無核無細(xì)胞分隔的體被所覆蓋。(2)血吸蟲成蟲寄生于哺乳動物血管中，體表與宿主血液直接接觸，為了逃避宿主的免疫性攻擊，體被覆蓋了一種與宿主紅細(xì)胞ab抗原相同的特異性糖類，成蟲體表呈現(xiàn)較強(qiáng)的親水性。(3)血吸蟲成蟲個體較大，對熒光的穿透性要求較高。鑒于目前熒光染料的不足和血吸蟲成蟲的生理結(jié)構(gòu)特征之間的矛盾，所以開發(fā)出對血吸蟲成蟲具有良好熒光標(biāo)記效果的熒光染料是一項挑戰(zhàn)。

本發(fā)明結(jié)合近紅外熒光染料的優(yōu)勢，如生物體極少在近紅外光譜區(qū)有自發(fā)熒光，使得近紅外熒光染料成像受背景熒光干擾很??；其次，因散射光強(qiáng)度與波長的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的近紅外熒光染料受其干擾小，對生物組織穿透能力強(qiáng)且損傷小。因此，發(fā)明人綜合考慮了熒光染料的激發(fā)和發(fā)射范圍、水溶性、血吸蟲生理特征等因數(shù)，借助近紅外熒光染料作為熒光探針應(yīng)用于血吸蟲成蟲的熒光標(biāo)記，成功地解決了血吸蟲成蟲熒光成像過程中熒光染色效果差、背景熒光干擾大和熒光穿透性差的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種近紅外熒光染料，使其具有對血吸蟲成蟲進(jìn)行熒光標(biāo)記的性能，可作為血吸蟲成蟲熒光標(biāo)記試劑。

本發(fā)明的近紅外熒光染料具體的結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明化合物可按照如下合成路線制備：

制備本發(fā)明化合物的原料和所用試劑均為已知化合物，可以在市場上獲得，或可用本領(lǐng)域已知的方法制備。

化合物1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚(1.0-2.0mmol)與3-溴丙酸(1.2-2.4mmol)在甲苯中110℃加熱24小時可得到產(chǎn)物M-1。所得中間產(chǎn)物M-1(1.0-2.0mmol)與N,N’-二苯基甲脒(10-2.0mmol)在乙酸酐的溶液中110℃加熱2小時得到產(chǎn)物M-2。產(chǎn)物M-2(1.0-2.0mmol)與3-(3-磺酸基-丙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚(1.0-2.0mmol)在醋酸鉀與乙酸酐的混合溶液中70℃加熱反應(yīng)2小時，合成目標(biāo)熒光染料NIR-COOH-SO₃H。

上述熒光染料作為血吸蟲成蟲熒光標(biāo)記探針，熒光標(biāo)記方法包括如下步驟：

(1)獲取血吸蟲尾蚴：尾蚴從感染毛蚴的陽性的釘螺得到，取陽性螺放入清水中，在白熾燈下光照2小時左右逸出新鮮尾蚴。

(2)小鼠感染：將六周齡雌性小鼠剪去小鼠腹部體毛，取溫水濕潤小鼠腹部皮膚，并將含有50條左右尾蚴的蓋玻片貼于小鼠去毛的腹部皮膚上，保持20分鐘使尾蚴穿透小鼠皮膚進(jìn)行感染。

(3)獲取血吸蟲成蟲：將感染后的小鼠飼養(yǎng)6周后，使其頸部脫臼致死，嚴(yán)格按照無菌操作要求，依次剖開腹部皮膚、腹膜，采取灌注法于肝門-腸系膜靜脈中收集成蟲。將收集到的成蟲在生理鹽水中漂洗3次后分配到培養(yǎng)皿中，加入RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時后，鏡檢篩選活性良好的蟲體用于熒光成像。

(4)血吸蟲成蟲熒光成像：熒光染料用二甲基亞砜(DMSO)溶解準(zhǔn)確配制成1mmol的母液，然后再用PBS緩沖液稀釋成5μM的稀釋液。移取200μL稀釋液加入到培養(yǎng)皿中，用鑷子挑取成蟲加入到熒光染料稀釋液中，于室溫孵育5分鐘至6小時后，將成蟲轉(zhuǎn)移到熒光成像器皿，在635nm激發(fā)下共聚焦熒光顯微鏡觀察成蟲的熒光標(biāo)記情況，采集650-750nm的熒光信號進(jìn)行熒光成像。

發(fā)明人通過設(shè)計與合成，將近紅外有機(jī)熒光染料用于血吸蟲成蟲熒光標(biāo)記的研究，可以成功地解決成蟲熒光成像過程中熒光標(biāo)記效果差、背景熒光干擾大和光穿透性差的不足。

附圖說明

圖1熒光染料NIR-COOH-SO₃H的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

圖2熒光染料NIR-COOH-SO₃H細(xì)胞激光共聚焦熒光成像圖

圖3熒光染料NIR-COOH-SO₃H標(biāo)記日本血吸蟲成蟲的激光共聚焦熒光成像圖

圖4熒光染料NIR-COOH-SO₃H標(biāo)記日本血吸蟲成蟲頭器的激光共聚焦熒光成像圖

圖5熒光染料NIR-COOH-SO₃H標(biāo)記日本血吸蟲熒光成像的信噪比圖

具體實施方式

下文給出了本發(fā)明化合物的具體實施例，它們用實例詳細(xì)說明本發(fā)明，但對本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。本實施例中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得，或可按相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計方法合成。

在下述實施例中，所涉及的理化參數(shù)由下述儀器測定的：¹H NMR譜在Bruker Mercuryplus上采用400MHz測定，用TMS為內(nèi)標(biāo)；質(zhì)譜數(shù)據(jù)MALDI-TOF-MS在AB SCIEX5800型質(zhì)譜儀上獲得；紫外可見吸收光譜在Shimadzu UV-2700紫外-可見吸收光譜儀上完成；熒光發(fā)射光譜由PerkinElmer LS-55熒光光譜儀上測定；血吸蟲成蟲熒光成像在OLYMPUS FV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡上進(jìn)行采集，激光器提供635nm的激發(fā)光源，收集650nm-750nm范圍內(nèi)的發(fā)射熒光信號。

實施例1

熒光染料NIR-COOH-SO₃H的合成：

(1)M-1的合成：將1mmol的1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚，1.2mmol的3-溴丙酸，加入到三頸燒瓶中，然后加入30mL甲苯作溶劑。在氮氣的保護(hù)下，反應(yīng)體系在110℃反應(yīng)24小時。冷卻至室溫，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有機(jī)層，用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到M-1。核磁表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.07(dd,J＝13.6,8.3Hz,5H),7.80–7.54(m,2H),4.05(d,J＝7.0Hz,2H),3.26(s,5H),1.87(s,6H),1.19(t,J＝6.9Hz,3H)。

(2)M-2的合成：1mmol的M-1和1mmol的N,N’-二苯基甲脒，溶于25mL的醋酸酐中，110℃反應(yīng)2小時。冷卻至室溫，加入碳酸氫鈉水溶液中和，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有機(jī)層，用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到M-2。高分辨質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)：MALDI-TOF-MS:m/z 453.2175。

(3)NIR-COOH-SO₃H的合成：將1.0mmol的M-2化合物，1.0mmol的3-(3-磺酸基-丙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚和1.0mmol的醋酸鉀加入圓底燒瓶中，然后加入30mL醋酸酐。在氮氣的保護(hù)下，反應(yīng)體系在70℃反應(yīng)2小時。冷卻至室溫，加入碳酸氫鈉水溶液中和，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取(10mL×3)，柱層析分離得到NIR-COOH-SO₃H。核磁表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.38(s,2H),8.22(s,2H),7.98(d,J＝8.1Hz,4H),7.71(d,J＝8.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,3H),7.46(s,2H),6.71(t,J＝12.3Hz,1H),6.49(d,J＝13.5Hz,1H),6.35(d,J＝11.1Hz,1H),4.50(s,4H),3.05(t,J＝6.6Hz,2H),2.84(t,J＝6.9Hz,2H),2.40–2.22(m,2H),1.99(s,12H)。高分辨質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)：MALDI-TOF-MS:m/z 649.2711。

實施例2

熒光染料NIR-COOH-SO₃H的吸收光譜和熒光光譜測試：

熒光染料NIR-COOH-SO₃H配成1mmol·L^-1的乙醇母液，然后稀釋用于測試。紫外光譜測定：掃描范圍500nm-850nm，記錄其紫外吸收光譜特征。上述測定的溶液再用于測定熒光光譜。熒光光譜測定：激發(fā)波長620nm，發(fā)射光譜范圍640nm-850nm。吸收光譜和熒光光譜如圖1所示，測試結(jié)果表明該熒光染料的發(fā)射峰位于650-850nm的近紅外區(qū)域。

實施例3

熒光染料NIR-COOH-SO₃H的細(xì)胞熒光成像：

(1)試劑與材料

二甲基亞砜(AR)購于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購于賽默飛世爾科技公司，人類宮頸癌細(xì)胞HeLa購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

(2)細(xì)胞熒光成像

人類宮頸癌細(xì)胞HeLa培養(yǎng)于含10％胎兒牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO₂和95％空氣氛中貼壁生長。熒光染料NIR-COOH-SO₃H的細(xì)胞熒光成像在OLYMPUS FV1000型激光共聚焦熒光顯微鏡上進(jìn)行測試，激發(fā)波長為635nm，收650-750nm的熒光信號。細(xì)胞熒光成像結(jié)果如圖2所示，實驗結(jié)果表明染料NIR-COOH-SO₃H能夠很好地對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。

實施例4

熒光染料NIR-COOH-SO₃H對血吸蟲成蟲的熒光標(biāo)記成像：

(1)試劑與材料

試劑：二甲基亞砜(AR)購于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購于賽默飛世爾科技公司，磷酸緩沖液(PBS,pH＝7.4)自制。

尾蚴：由陽性釘螺得到，陽性釘螺由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供。

(2)獲取血吸蟲尾蚴

尾蚴從感染毛蚴的陽性的釘螺得到，取陽性螺放入清水中，在白熾燈下光照2小時左右逸出新鮮尾蚴。

(3)小鼠感染

將六周齡雌性小鼠剪去小鼠腹部體毛，取溫水濕潤小鼠腹部皮膚，并將含有50條左右尾蚴的蓋玻片貼于小鼠去毛的腹部皮膚上，保持20分鐘使尾蚴穿透小鼠皮膚進(jìn)行感染。

(4)獲取血吸蟲成蟲

將感染后的小鼠飼養(yǎng)6周后，使其頸部脫臼致死，依次剖開腹部皮膚、腹膜，采取灌注法于肝門-腸系膜靜脈中收集成蟲。將收集到的成蟲在生理鹽水中漂洗3次后分配到培養(yǎng)皿中，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時后，鏡檢篩選活性良好的蟲體用于熒光成像。

(5)血吸蟲成蟲熒光標(biāo)記成像方法

熒光染料NIR-COOH-SO₃H用二甲基亞砜(DMSO)溶解準(zhǔn)確配制成1mmol的母液，然后用PBS緩沖液稀釋成5μM的稀釋液。移取200μL稀釋液加入到培養(yǎng)皿中，用鑷子挑取成蟲加入到有機(jī)熒光染料稀釋液中，于室溫下孵育5分鐘至6小時后，將成蟲轉(zhuǎn)移到熒光成像專用器皿，在635nm激發(fā)下采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察成蟲的熒光標(biāo)記情況，并采集650-750nm的熒光信號進(jìn)行熒光成像。

(6)熒光標(biāo)記結(jié)果

具體標(biāo)記結(jié)果參見圖3、圖4和圖5，從熒光成像圖可以得出：熒光探針NIR-COOH-SO₃H能夠?qū)ρx成蟲進(jìn)行熒光標(biāo)記成像。同時，我們對血吸蟲成蟲熒光強(qiáng)度進(jìn)行了定量分析，如圖5所示，圖中直線上背景區(qū)域1(參比)和蟲體區(qū)域2的熒光信號信噪比S/N>10，表明了該近紅外熒光染料用于血吸蟲成蟲的熒光成像具有高信噪比。