本發(fā)明涉及一種近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針的制備及應(yīng)用，屬于化學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥是最嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病問題之一，最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，2015年中國(guó)有429.2萬例新發(fā)腫瘤病例和281.4萬例死亡病例。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)原位腫瘤，以及手術(shù)后殘余的腫瘤，并能盡早控制腫瘤是目前的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，探索有效快速的方法來探測(cè)腫瘤對(duì)癌癥治療至關(guān)重要。

臨床診斷檢測(cè)腫瘤主要方式包括磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）、正電子體層成像（Positron Emission Tomography, PET）和X-射線等，在一定程度上這些方式缺少一定的靶向性和靈敏度，并且伴隨著一定的輻射損傷。光學(xué)成像（Optical Tomography）是近幾年新興的有前途的癌癥診斷檢測(cè)方式。光學(xué)成像能夠?qū)崟r(shí)高分辨無損傷檢測(cè)癌癥，并且這種光學(xué)信號(hào)能夠提供分子生物學(xué)信息和腫瘤相關(guān)結(jié)構(gòu)以及腫瘤的代謝，為下一步的診斷治療提供一定的依據(jù)。

在光學(xué)成像技術(shù)中，有機(jī)小分子熒光染料尤其是近紅外熒光染料（Near-Infrared, NIR）在腫瘤的診斷治療領(lǐng)域中展現(xiàn)出了巨大的潛力，對(duì)于腫瘤的診療具有身份重大的意義。近紅外熒光探針（發(fā)射波長(zhǎng)：650-900 nm）能夠避免血紅蛋白、色素、膽紅素等物質(zhì)在可見光區(qū)（400-650 nm）強(qiáng)吸收，有較低的背景干擾，能夠在活體生物組織內(nèi)實(shí)時(shí)通過深穿透能力的熒光監(jiān)測(cè)成像效果。因此，近紅外染料在腫瘤的診斷中已經(jīng)得到廣泛的研究與應(yīng)用。

尼羅紅（Nile）染料是近紅外染料中的一種，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為600 nm和670 nm。這使得尼羅紅在體內(nèi)外成像時(shí)能夠降低體內(nèi)自身背景的干擾，提高信噪比。此外，尼羅紅還具有雙光子性質(zhì)，雙光子成像采用飛秒激光器作為激發(fā)光源，采用長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外作為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)組織細(xì)胞的損傷較小，能夠同時(shí)吸收兩個(gè)光子聚焦在微小的點(diǎn)上，能夠進(jìn)行更清晰地成像。因此，尼羅紅染料可以同時(shí)進(jìn)行近紅外和雙光子雙模式成像，使得活體和組織成像相互驗(yàn)證，提高信號(hào)的準(zhǔn)確性。但是，采用尼羅紅作為近紅外熒光染料進(jìn)行細(xì)胞成像時(shí)，尼羅紅本身不具有靶向性，在體內(nèi)的正常組織和腫瘤細(xì)胞中均能夠成像，容易造成假陽性，不利于腫瘤檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性的近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針及其制備和應(yīng)用。

技術(shù)方案

一種近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示：

式I中，R₁=R₂=CH₃。

一種上述近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針的制備方法，是將化合物2、化合物3、1-羥基苯并三唑（HOBT）、N,N-二異丙基乙胺（DIEA）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離純化，得棕色產(chǎn)物；

化合物2的結(jié)構(gòu)式：，

化合物3的結(jié)構(gòu)式：。所得棕色產(chǎn)物即為本發(fā)明的近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針。

上述制備方法，可以采用薄層色譜分析檢測(cè)法（TLC）檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，或者，反應(yīng)24h以上。

上述制備方法，可以使用硅膠柱進(jìn)行分離純化。

上述近紅外及雙光子雙模式成像熒光探針的應(yīng)用，用于細(xì)胞的熒光成像或/和雙光子成像。

上述應(yīng)用，包括根據(jù)熒光成像或/和雙光子成像結(jié)果，判斷細(xì)胞是否是陽性細(xì)胞；所述陽性細(xì)胞為生物素受體表達(dá)高于正常細(xì)胞的細(xì)胞。

本發(fā)明的熒光探針，具有良好的光譜性質(zhì)?；衔?（尼羅紅）和化合物2（尼羅紅衍生物）在DMSO:PBS(1:9)和EtOH:PBS(1:9)體系中的最大吸收光譜均在590nm處；本發(fā)明的探針除了在590nm處有吸收，還在540nm處出現(xiàn)了最大吸收峰，出現(xiàn)了藍(lán)移，可能是生物素的加入影響了化合物2對(duì)光譜的吸收。熒光光譜中，分別用540nm和590nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，在DMSO:PBS(1:9)和EtOH:PBS(1:9)體系中都在660nm處出現(xiàn)了最大發(fā)射波長(zhǎng)，與化合物1和2的最大發(fā)射波長(zhǎng)和峰型保持一致，充分說明生物素的加入并沒有影響化合物2的熒光性質(zhì)。與此同時(shí)，在相同濃度下，本發(fā)明的熒光探針的熒光強(qiáng)度還強(qiáng)于化合物1和2，由此可以看出生物素在本發(fā)明中還具有一定的增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的作用。

本發(fā)明研究了本發(fā)明的熒光探針對(duì)活細(xì)胞的毒性：采用MTT比色法，通過分析細(xì)胞在加入探針之后的存活率，討論探針對(duì)細(xì)胞的毒性。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用本發(fā)明的熒光探針對(duì)活細(xì)胞、活組織和活動(dòng)物進(jìn)行成像研究，檢測(cè)探針在陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞中的成像差別，在活組織中的近紅外和雙光子雙模式成像效果以及在陽性腫瘤模型中的成像效果。實(shí)驗(yàn)證明：本探針沒有毒性。另外，本發(fā)明的熒光探針，在具備良好光譜性質(zhì)的同時(shí)還對(duì)腫瘤細(xì)胞有靶向作用，是一種靶向近紅外熒光探針；一方面在不破壞組織樣品的前提下能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)體內(nèi)信號(hào)；另一方面能夠提高信號(hào)在腫瘤內(nèi)的富集，提高信噪比。

本發(fā)明的熒光探針，既可以進(jìn)行近紅外成像，同時(shí)也能夠進(jìn)行雙光子成像，兩種模式相互驗(yàn)證，能提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的熒光探針，具有良好的熒光發(fā)射光譜特性（630-690nm），同時(shí)也能夠進(jìn)行雙光子成像，兩種模式相互驗(yàn)證，能提高結(jié)果的準(zhǔn)確性；對(duì)腫瘤細(xì)胞有靶向作用，能夠提高信號(hào)在腫瘤內(nèi)的富集，提高信噪比；能在不破壞組織樣品的前提下能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)體內(nèi)信號(hào)。

本發(fā)明的熒光探針，可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行，原料廉價(jià)易得，制備成本低，易于推廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的熒光探針的HRMS圖譜；

圖2是本發(fā)明的熒光探針的熒光光譜圖；

圖3是陽性細(xì)胞在各熒光探針中的熒光成像圖及競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)熒光成像圖；

圖4是圖3對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；

圖5是陰性細(xì)胞在各熒光探針中的熒光成像圖；

圖6是圖5對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；

圖7是本發(fā)明的熒光探針的活組織近紅外和雙光子雙模式成像圖；

圖3中，第一排為N-BN的成像結(jié)果：a為細(xì)胞明場(chǎng)，b為單光子熒光圖（Ex= 561 nm, Em= 570-620 nm），c為a與b的組合,d為雙光子熒光圖（Ex=820 nm, Em= 570-620 nm）；第二排為N-BN與生物素（biotin）的競(jìng)爭(zhēng)成像結(jié)果：e為細(xì)胞明場(chǎng)，f為單光子熒光圖（Ex= 561 nm, Em= 570-620 nm），g為e與f的組合,h為雙光子熒光圖（Ex=820 nm, Em= 570-620 nm）；第三排為N-OH的成像結(jié)果：i為細(xì)胞明場(chǎng)，j為單光子熒光圖（Ex= 561 nm, Em= 570-620 nm），k為i與j的組合,l為雙光子熒光圖（Ex=820 nm, Em= 570-620 nm）；

圖4中，從左至右，依次為N-BN、N-BN與生物素、N-OH的單光子熒光強(qiáng)度，N-BN、N-BN與生物素、N-OH的雙光子熒光強(qiáng)度；

圖5中，第一橫排為N-BN的成像結(jié)果，第二橫排為N-OH的成像結(jié)果；第一豎排為細(xì)胞明場(chǎng)，第二豎排為單光子熒光圖（Ex= 561 nm, Em= 570-620 nm），第三豎排為第一豎排和第二豎排的疊加,第四豎排為雙光子熒光圖（Ex=820 nm, Em= 570-620 nm）；

圖6中，從左至右，依次為N-BN、N-OH的單光子熒光強(qiáng)度，N-BN、N-OH的雙光子熒光強(qiáng)度；

圖7中，上圖為實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物在腫瘤組織中的單光子近紅外成像結(jié)果（NIR Imaging），下圖為實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物在腫瘤組織中的雙光子近紅外成像結(jié)果（TP Imaging）；上圖從左至右表示單光子設(shè)置下，實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物在腫瘤組織中每隔10μm的熒光強(qiáng)度和穿透深度（130μm）；下圖從左至右表示雙光子設(shè)置下，實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物在腫瘤組織中每隔10μm的熒光強(qiáng)度和穿透深度（130μm）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。

實(shí)施例1 本發(fā)明熒光探針的制備

將化合物2(1mmol)、化合物3(1mmol)、1-羥基苯并三唑（HOBT，2.5mmol）、N,N-二異丙基乙胺（DIEA，2.5mmol）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF，5mL）加入到50mL單口燒瓶中，室溫避光攪拌24小時(shí)。使用硅膠柱分離純化，得到棕色產(chǎn)物（產(chǎn)率67%）。對(duì)綜色產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，HRMS圖譜見圖1，其結(jié)構(gòu)式為：，即為本發(fā)明的熒光探針。本實(shí)施例中，化合物2的結(jié)構(gòu)式：，化合物3的結(jié)構(gòu)式：?；衔?的CAS號(hào)為58-85-5?；衔?的方法：3-二乙胺基苯酚2mmol在冰浴的條件下慢慢加入5mL 質(zhì)量濃度為18％的鹽酸，然后加入2.4 mmol的亞硝酸鈉，反應(yīng)12h以上；用二氯甲烷萃取后過硅膠柱純化得到5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚。在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，將3mmol5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚與3mmol1,6-二羥基奈3mmol溶于 8mLDMF中，140℃，回流12h以上。用二氯甲烷萃取后過硅膠柱純化即可得到化合物2（0.88 g, 產(chǎn)率85%）。

實(shí)施例2 本發(fā)明熒光探針在不同水溶液中的熒光光譜

分別以尼羅紅、化合物2、實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物作為熒光探針，檢測(cè)他們?cè)诓煌彌_液中的熒光光譜。

將上述熒光探針分別與含10%DMSO的Britton-Robinson緩沖溶液、含10%EtOH的Britton-Robinson緩沖溶液混合，制成熒光探針濃度為10μmol/L的緩沖液，并將緩沖液的pH調(diào)整為7.54。然后分別以540nm、590nm作為激發(fā)波長(zhǎng)（λ_ex =540nm、590nm）進(jìn)行熒光檢測(cè)；所得熒光光譜如圖2所示。根據(jù)圖2可以得出：以尼羅紅、化合物2、實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物作為探針的熒光圖譜，都在660 nm處出現(xiàn)了最大發(fā)射波長(zhǎng)，與且峰型相同；與此同時(shí)，在相同濃度下，實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物作為熒光探針的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于尼羅紅、化合物2作為熒光探針的熒光強(qiáng)度。所述％為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

實(shí)施例3 本發(fā)明熒光探針在陽性和陰性細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度

分別以化合物2（簡(jiǎn)稱N-OH）、實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物（簡(jiǎn)稱N-BN）作為熒光探針，檢測(cè)他們?cè)陉栃院完幮约?xì)胞中的熒光光譜。所述陽性細(xì)胞為生物素受體高表達(dá)的細(xì)胞系（HeLa）；所述陰性細(xì)胞為生物素受體低表達(dá)的細(xì)胞（NIH3T3）。

將生物素受體高表達(dá)的細(xì)胞HeLa（陽性細(xì)胞）或生物素受體低表達(dá)的細(xì)胞NIH3T3（陰性細(xì)胞）接種到35mm的共聚焦小皿中培養(yǎng)24h，然后更換含有5μmol/L熒光探針）的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育15min，用PBS洗三次，置于共聚焦顯微鏡（配有飛秒激光器）下檢測(cè)陽性細(xì)胞或陰性細(xì)胞在熒光探針中的熒光成像結(jié)果（λex = 560 nm，λem= 570nm-620 nm）。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：按照1mmol/L的用量將生物素（Biotin）提前孵育到陽性細(xì)胞HeLa中，30min后加入按照5μmol/L的用量加入實(shí)施例1制備的棕色產(chǎn)物（N-BN），再孵育15min,用PBS洗三次，置于共聚焦顯微鏡（配有飛秒激光器）下檢測(cè)陽性細(xì)胞在實(shí)施例1制備的棕色產(chǎn)物（N-BN）中的熒光成像結(jié)果（λex=560nm，λem=570nm-620nm）。采用作圖軟件Graph Pad (Prism 5)作圖；用軟件imageJ計(jì)算每組圖的熒光強(qiáng)度。其中，陽性細(xì)胞在各熒光探針中的熒光成像結(jié)果及競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)熒光成像如圖3所示，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度如圖4所示；陰性細(xì)胞在各熒光探針中的熒光成像結(jié)果如圖5所示，對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度如圖6所示。

根據(jù)圖3和4可以得出：第一排的熒光強(qiáng)于第二排，本發(fā)明的熒光探針是通過受體（生物素受體）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的，生物素在本發(fā)明的熒光探針中起到了很好的靶向成像結(jié)果；第一排的熒光強(qiáng)于第三排，證明本發(fā)明的熒光探針的在陽性細(xì)胞中主要通過生物素受體進(jìn)入細(xì)胞，本發(fā)明的熒光探針的生物素起到很好的靶向富集作用?？傊?，通過圖3和4能夠充分的證明本發(fā)明的熒光探針的靶向成像富集成像作用，同時(shí)還能夠在雙光子模式下進(jìn)行成像。

根據(jù)圖5和6可以得出：在生物素受體低表達(dá)的陰性細(xì)胞3T3中，實(shí)施例1制備的棕色產(chǎn)物（N-BN）的熒光強(qiáng)度很弱，與陽性細(xì)胞HeLa的熒光強(qiáng)度相比具有很明顯的差異，說明實(shí)施例1制備的棕色產(chǎn)物（N-BN）主要是通過生物素受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，具有很好的靶向富集作用；化合物2在3T3細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度比較弱，與在HeLa中的效果基本一致，輔助證明受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用能夠有效的增加探針在細(xì)胞內(nèi)的富集。

實(shí)施例4：本發(fā)明熒光探針在活腫瘤組織中的成像應(yīng)用

用陽性細(xì)胞系4T-1細(xì)胞（小鼠乳腺癌細(xì)胞，生物素受體高表達(dá)的細(xì)胞系）構(gòu)建腫瘤模型，待腫瘤體積達(dá)到50mm³，小鼠采用頸椎脫臼方法處死后取出腫瘤組織，PBS清洗3次。以實(shí)施例1獲得的棕色產(chǎn)物作為熒光探針，配置熒光探針濃度為10μmol/L的培養(yǎng)液，腫瘤組織用培養(yǎng)液培養(yǎng)1h，然后進(jìn)行近紅外和雙光子成像測(cè)試。測(cè)試條件：紅色通道，激發(fā)波長(zhǎng)為560nm，收集波長(zhǎng)為570-620 nm；雙光子通道，激發(fā)波長(zhǎng)為820 nm，收集波長(zhǎng)為570-620 nm。結(jié)果見圖7。

通過圖7能夠充分得出：實(shí)施例1制備的棕色產(chǎn)物（N-BN）能夠在腫瘤組織水平中進(jìn)行單光子和雙光子雙模式成像，在兩種模式中具有很好的穿透力。兩種模式相互佐證，為腫瘤的檢測(cè)提供強(qiáng)有力的依據(jù)。