本發(fā)明涉及一種無機-有機比率熒光探針及其在半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

作為生物體內(nèi)重要的含巰基生物小分子，半胱氨酸（cys）和同型半胱氨酸（hcy）在維持機體氧化還原平衡起著至關(guān)重要的作用。半胱氨酸含量缺失會引起毛發(fā)色素脫失、組織浮腫、嗜睡、肝臟損傷，皮膚損害，兒童生長緩慢等疾病。同型半胱氨酸水平也被證明與一系列疾病有關(guān)，包括癌癥、老年癡呆癥、心血管疾病等。因此，發(fā)展快速、靈敏、準確的檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸的分析方法，對于多種疾病的診斷具有重要的意義。基于熒光法高靈敏度、高選擇性、快速的響應(yīng)時間以及非生物破壞性等優(yōu)點，在半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測方法中受到廣泛的關(guān)注。

目前，基于不同機理用于檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸的有機熒光探針被廣泛研究，主要包括邁克爾加成反應(yīng)、與醛基進行成環(huán)反應(yīng)、磺酰胺鍵斷裂反應(yīng)以及其他的一些反應(yīng)機理。然而，大多數(shù)已報道的熒光探針是基于單發(fā)射波長的檢測實現(xiàn)的，由此可能因生物背景干擾而產(chǎn)生“假陽性”的結(jié)果。

作為一種新型的熒光無機納米材料，金納米簇（auncs）因其高的光致發(fā)光特性、良好的生物相容性、低的細胞毒性，在生物成像和生物傳感等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。牛血清白蛋白（bsa）為模板合成的金納米簇具有優(yōu)良的熒光性能，能夠在可見光下激發(fā)（400-520nm）并具有較大的斯托克斯位移（發(fā)射波長630nm左右）。由于其良好的光穩(wěn)定性、生物相容性和低細胞毒性，使得bsa包裹的金納米簇具有熒光成像的潛力。因此，通過構(gòu)建無機-有機比率熒光探針，能夠提供一個內(nèi)置的校正而避免環(huán)境效應(yīng)的干擾。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種無機-有機比率熒光探針及其在半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明構(gòu)建了單激發(fā)波長激發(fā)來實現(xiàn)雙發(fā)射波長的熒光探針。以4-氯-7-硝基-苯并呋咱為熒光團與對甲基苯硫酚反應(yīng)合成硫醚取代的硝基苯并呋咱有機熒光探針，通過親核取代反應(yīng)實現(xiàn)對半胱氨酸和同型半胱氨酸的檢測。采用bsa為模板合成具有熒光性質(zhì)的金納米簇，并在其表面氨基和羧基進行修飾。合成硫醚取代的硝基苯并呋咱有機分子含有的氨基，通過酯化反應(yīng)與金納米簇表面羧基反應(yīng)，構(gòu)建無機-有機復合熒光探針。單獨無機-有機復合探針表現(xiàn)出金納米簇的熒光，發(fā)射波長在630nm處，與半胱氨酸和同型半胱氨酸反應(yīng)后，探針通過有機分子對半胱氨酸和同型半胱氨酸的“off-on”響應(yīng)，在540nm處產(chǎn)生新的熒光峰，而金納米簇在630nm處的熒光在反應(yīng)前后具有良好的穩(wěn)定性，通過單激發(fā)波長實現(xiàn)了雙發(fā)射波長檢測的目的。與傳統(tǒng)單波長檢測的熒光探針相比，通過雙發(fā)射波長測定的比率熒光探針，能夠提供一個內(nèi)置的校正而避免環(huán)境效應(yīng)的干擾，從而提高檢測的準確性。此外，無機-有機比率熒光探針具有高選擇性、良好水溶性、較低檢測限以及良好生物相容性，使得熒光探針成功地應(yīng)用于hela細胞中半胱氨酸和同型半胱氨酸的生物成像。

一種無機-有機比率熒光探針，其特征在于該熒光探針通過以下步驟制備得到：

1）硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物的合成：將4-氨基苯硫酚和三乙胺溶于無水四氫呋喃中，加入4-氯-7-硝基-苯并呋咱在氮氣保護下加熱回流1~6h，待反應(yīng)結(jié)束后用水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物并用二氯甲烷萃取數(shù)次，合并有機相，用無水硫酸鎂干燥即得粗產(chǎn)物，然后將粗產(chǎn)物進行柱色譜分離即得硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物；

2）無機-有機比率熒光探針的制備：將牛血清白蛋白為模板制得的金納米簇用磷酸緩沖鹽溶液（pbs）稀釋10倍，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（edc）和n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）反應(yīng)15min，隨后加入硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物的n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶液，在室溫攪拌反應(yīng)12h，最后將反應(yīng)產(chǎn)物在pbs緩沖溶液中透析24h即得無機-有機比率熒光探針。

所述4-氨基苯硫酚、三乙胺和4-氯-7-硝基-苯并呋咱的摩爾比為1：1~3：1~2。

所述柱色譜分離的條件：二氯甲烷為洗脫劑，硅膠為固定相。

所述edc和nhs在步驟2）反應(yīng)溶液中的濃度均為10mg/ml。

所述硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物的n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶液的體積占步驟2）反應(yīng)溶液體積的10%。

所述透析用的透析袋的規(guī)格為mwco:3500。

所述無機-有機比率熒光探針在半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下：

1）用pbs緩沖溶液稀釋無機-有機比率熒光探針至探針的濃度為10~40μgauml^-1；

2）將步驟1）所得無機-有機比率熒光探針的pbs緩沖溶液中分別加入不同濃度的半胱氨酸或同型半胱氨酸水溶液，反應(yīng)10~60分鐘，然后用熒光分光光度計測定在480nm激發(fā)波長下無機-有機比率熒光探針與不同濃度半胱氨酸或同型半胱氨酸作用在540nm和630nm處的熒光發(fā)射強度變化，隨著半胱氨酸和同型半胱氨酸濃度的增加，相應(yīng)在540nm發(fā)射強度增加，而在630nm的發(fā)射波長保持基本恒定，從而實現(xiàn)比率檢測cys和hcy。

所述pbs緩沖溶液的濃度為50mm，ph為7.4。

將無機-有機比率熒光探針的pbs緩沖溶液分別加入濃度為1.0×10^-3m的干擾物水溶液中反應(yīng)20分鐘，然后用熒光分光光度計測定在480nm激發(fā)波長下，探針與干擾物作用在540nm和630nm處的熒光發(fā)射波長強度變化，均不能引起探針在540nm發(fā)射光譜的變化，即無機-有機比率熒光探針在540nm和630nm處的熒光發(fā)射波長強度比值i540/i630相比空白并未有明顯的變化。干擾物為谷胱甘肽（gsh），胱氨酸（cystine），組氨酸（his），色氨酸（trp），酪氨酸（tyr），精氨酸（arg），脯氨酸（pro），丙氨酸（ala），絲氨酸（ser），蛋氨酸（met），異亮氨酸（ile），谷氨酸（glu），苯丙氨酸（phe），天冬氨酸（asp），甘氨酸（gly）和纈氨酸（val），具體結(jié)果見圖2。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1．所述無機-有機比率熒光探針相比有機分子具有良好的水溶性，可實現(xiàn)純水體系半胱氨酸和同型半胱氨酸的檢測。

2．所述無機-有機比率熒光探針在半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測過程中，通過雙發(fā)射波長測定，能夠提供一個內(nèi)置的校正而避免環(huán)境效應(yīng)的干擾。

3．所述無機-有機比率熒光探針對半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測具有高選擇性和較低的檢出限。

附圖說明

圖1：無機-有機比率熒光探針用于不同濃度半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測的熒光圖。

圖2：無機-有機比率熒光探針用于半胱氨酸和同型半胱氨酸及干擾物檢測的熒光比值圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1：無機-有機比率熒光探針的制備方法。

依次包括以下步驟：

1．硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物的合成：將4-氨基苯硫酚（0.125g）和三乙胺（0.303g）溶于20ml無水四氫呋喃中，再加入4-氯-7-硝基-苯并呋咱（0.199g），氮氣保護下加熱回流4h。

2．上述反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物用水稀釋后，用二氯甲烷萃取三次后，合并有機相，無水硫酸鎂干燥。反應(yīng)粗產(chǎn)物進而減壓旋干，進行柱色譜分離：以100%二氯甲烷為洗脫劑，硅膠為固定相，收集洗脫液，除去洗脫劑（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)），得到硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物（產(chǎn)率72%）。

3．無機-有機比率熒光探針的制備：將2ml牛血清白蛋白為模板制得的金納米簇加入到16mlpbs緩沖溶液（50mm，ph=7.4），后加入0.2gedc和0.2gnhs。反應(yīng)15min后，加入2ml硫醚取代的硝基苯并呋咱有機化合物（1.0×10^-3m）的dmf溶液，繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)12h。最后，將得到的納米有機復合物在pbs緩沖溶液（50mm，ph=7.4）中透析（mwco:3500）24h。

實施例2：熒光分光光度計檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸。

以pbs緩沖溶液（50mm，ph=7.4）為溶劑稀釋制備合成的無機-有機比率熒光探針的檢測試劑，探針的濃度為40μgauml^-1。探針的濃度為（40μgauml^-1）的pbs緩沖溶液（50mm，ph=7.4）中，分別加入濃度為8.3×10^-6m~1.0×10^-4m的半胱氨酸和同型半胱氨酸反應(yīng)20分鐘，用熒光分光光度計測定在480nm激發(fā)波長下，探針與半胱氨酸和同型半胱氨酸作用在540nm處出現(xiàn)新的熒光峰，并隨著半胱氨酸和同型半胱氨酸濃度的增加，相應(yīng)在540nm處熒光發(fā)射強度增加，而在630nm的發(fā)射波長隨著反應(yīng)濃度的增加保持基本恒定，從而計算i540/i630熒光比值，實現(xiàn)比率檢測半胱氨酸和同型半胱氨酸。

實施例3：hela細胞中半胱氨酸和同型半胱氨酸檢測。

探針（40μgauml^-1~100μgauml^-1）加入到hela細胞，在37℃條件下孵育4h后，用pbs緩沖溶液洗滌三次，激光共聚焦顯微鏡下成像。在488nm激光源激發(fā)下，在綠色通道（500-560nm）和紅色通道（580-690nm）同時觀察熒光成像，綠色通道和紅色通道同時觀察到熒光。在對照實驗組中，hela細胞首先與n-乙基馬來酰亞胺（5.0×10^-2m）孵育30min，再加入探針進而孵育4h，綠色和紅色通道激光共聚焦顯微鏡成像，綠色通道熒光強度明顯減弱，而紅色通道熒光基本沒有變化。證明探針具有細胞內(nèi)半胱氨酸和同型半胱氨酸成像的潛力。