本發(fā)明屬于碳納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)，同時(shí)還涉及該高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法，及該高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)在生物成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

重金屬量子點(diǎn)因其出色的發(fā)光性能被廣泛的研究，然而，他們大部分具有較高的毒性和較高的生產(chǎn)成本。探究生物相容性好、優(yōu)良光致發(fā)光性能、低毒，較小粒徑的熒光材料，并滿足生物成像、藥物運(yùn)輸、熒光油墨等應(yīng)用，具有較大潛在應(yīng)用價(jià)值。熒光碳量子點(diǎn)由生物相容性優(yōu)異的碳元素作為核心組件，量子點(diǎn)材料因其納米大小又常表現(xiàn)出宏觀尺寸材料所不具備的特異性能，并具有良好的光學(xué)性能，高亮度和小尺寸是碳量子點(diǎn)最具吸引力的兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因而吸引了科學(xué)家極大的關(guān)注。因碳量子點(diǎn)的平均尺寸小于10nm，易進(jìn)入細(xì)胞或動(dòng)物體后仍保持熒光性能，可用為熒光探針跟蹤生物大分子或生物反應(yīng)過程。因此，熒光碳量子點(diǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景，包括生物傳感、成像、光催化、藥物運(yùn)輸和熒光油墨等領(lǐng)域。

目前，研究者建立了多種制備熒光碳量子點(diǎn)的方法：激光刻蝕法、電弧放電法、化學(xué)氧化法、電化學(xué)法、超聲處理、微波輻射法和水熱法。其中，水熱法被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單、高效制備熒光碳量子點(diǎn)的方法，它是將所選碳源置于密閉的水熱反應(yīng)釜中，高溫下水熱反應(yīng)釜內(nèi)會(huì)產(chǎn)生高壓環(huán)境,使碳源發(fā)生碳化形成碳量子點(diǎn)，水熱法具有成本低、產(chǎn)率高、后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，目前己廣泛應(yīng)用于碳量子點(diǎn)制備領(lǐng)域，但其碳量子點(diǎn)的熒光活性位點(diǎn)少、產(chǎn)率低(大部分小于15％)、選擇性等成為發(fā)展的瓶頸。近年來，通過異原子摻雜等方法來克服，提高其產(chǎn)率及增加活性位點(diǎn)，其中采用氮摻雜是目前研究最多的方法，但普遍存在氮摻雜熒光效率不高，制備復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供的一種熒光效率高，制備簡(jiǎn)單，低毒、良好的生物相容性及水溶性、粒徑小的高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)。

本發(fā)明的另一目的在于提供該高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供該高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)在豆芽和宮頸癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)，其氮的含量可達(dá)15.5～19.2％，平均熒光壽命為4.41～4.51ns，熒光量子產(chǎn)率最高可達(dá)20.3～32.9％。

本發(fā)明的一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.010～0.040g/ml，超聲震蕩5～20min，再采用水熱法在180～220℃反應(yīng)8～24h獲取碳點(diǎn)溶液；

(2)將碳點(diǎn)溶液在17000～20000r/min超速離心20～40min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得碳點(diǎn)溶液。

本發(fā)明的高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)在豆芽和宮頸癌細(xì)胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知：本發(fā)明采用前驅(qū)體l-瓜氨酸為碳源，采用一步水熱法制備氮摻雜的碳量子點(diǎn)，本發(fā)明具有低細(xì)胞毒性和良好的生物相容性及水溶性，低毒，粒徑小等特點(diǎn)。適用于體內(nèi)外熒光成像、藥物運(yùn)輸、熒光油墨等領(lǐng)域。與其他含氮有機(jī)物為碳源合成的碳量子點(diǎn)相比，本發(fā)明制備的氮摻雜的碳量子點(diǎn)中氮的含量為15.5～19.2％，平均熒光壽命為4.46ns，熒光量子產(chǎn)率最高可達(dá)32.9％，且具有低細(xì)胞毒性和良好的生物相容性，在豆芽和宮頸癌細(xì)胞生物成像中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1本發(fā)明的氮摻雜碳量子點(diǎn)的紅外表征。

圖2本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的光電子能譜圖，其中(a)是全譜圖，(b)是碳元素的分峰圖，(c)是氮元素的分峰圖，(d)是氧元素的分峰圖。

圖3本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的熒光壽命圖。

圖4本發(fā)明的的氮摻雜碳量子點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的發(fā)射光譜圖。

圖5本發(fā)明的氮摻雜碳量子點(diǎn)的掃描電鏡(a)和透射電鏡(b)圖。

圖6本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的原子力顯微鏡表征圖。

圖7本發(fā)明的氮摻雜碳量子點(diǎn)的粒徑分布圖。

圖8本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率測(cè)試數(shù)據(jù)圖。

圖9本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的ph穩(wěn)定性測(cè)試數(shù)據(jù)圖。

圖10本發(fā)明的氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖11本發(fā)明的氮摻雜的熒光碳量子點(diǎn)在豆芽中的應(yīng)用。

圖12本發(fā)明的氮摻雜的熒光碳量子點(diǎn)在宮頸癌細(xì)胞(hela)中的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.010g/ml，超聲震蕩5min，再采用水熱法在180℃反應(yīng)8h獲取碳點(diǎn)溶液；

(2)將碳點(diǎn)溶液在17000r/min超速離心20min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為15.5％，平均熒光壽命為4.41ns，熒光量子產(chǎn)率為20.3％的碳點(diǎn)溶液。

實(shí)施例2

一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.020g/ml，超聲震蕩10min，再采用水熱法在200℃反應(yīng)12h獲取碳點(diǎn)溶液；

(2)將碳點(diǎn)溶液在18000r/min超速離心20min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為19.2％，平均熒光壽命為4.46ns，熒光量子產(chǎn)率為32.9％的的碳點(diǎn)溶液。

實(shí)施例3

一種高熒光氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將l-瓜氨酸溶解于去離子水中使其濃度為0.040g/ml，超聲震蕩20min，再采用水熱法在220℃反應(yīng)24h獲取碳點(diǎn)溶液；

(2)將碳點(diǎn)溶液在20000r/min超速離心40min，再用0.22μm濾膜過濾，獲得氮含量為18.6％，平均熒光壽命為4.51ns，熒光量子產(chǎn)率為28.3％的的碳點(diǎn)溶液。

試驗(yàn)例1

將實(shí)施例2中制備的碳點(diǎn)采用紅外和光電子能譜對(duì)其表面官能團(tuán)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；熒光壽命、熒光發(fā)射光譜是對(duì)其光致發(fā)光性能進(jìn)行表征；原子力顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡是對(duì)其粒徑大小、高度等表面形貌特征進(jìn)行表征；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

圖1紅外光譜圖，3433cm^-1為–nh伸縮振動(dòng)峰；1625cm^-1處為c＝o伸縮振動(dòng)峰；1408cm^-1為c-o的伸縮振動(dòng)峰；674cm^-1為c-h的面外彎曲震動(dòng)吸收峰。圖2光電子能譜及分峰圖，284.78、400.48、530.38ev分別對(duì)應(yīng)圖中的c1s、n1s、o1s吸收峰，且碳點(diǎn)中c、n、o的原子含量分別為54.5％、19.2％、26.3％，再對(duì)c1s、n1s、o1s吸收峰進(jìn)行分峰，c1s：284.38、284.48、285.38、287.38ev分別對(duì)應(yīng)的為c-c、c-n、c-o、c＝o鍵；n1s：398.98、400.28、400.68ev分別對(duì)應(yīng)的為n-h、c-n、c-n-c鍵；o1s：530.38、531.38ev分別對(duì)應(yīng)的為c＝o、c-oh鍵。綜合紅外和光電子能譜及原材料的分子結(jié)構(gòu)，可以確定存在–oh、coo-、-nh2這些官能團(tuán)。通過儀器測(cè)量，碳點(diǎn)的平均熒光壽命為見圖3。圖4為其熒光發(fā)射光譜，考查了320～600nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在激發(fā)波長(zhǎng)為360nm條件下，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。圖5和圖6分別為掃描電鏡、透射電鏡圖和原子力顯微鏡圖，經(jīng)形貌測(cè)量，實(shí)施例2氮摻雜碳量子點(diǎn)的平均高度和粒徑大約為2nm，近乎微觀準(zhǔn)球形的碳納米材料，且碳點(diǎn)的粒徑分布符合正態(tài)分布(圖7)。

試驗(yàn)例2

測(cè)量熒光量子產(chǎn)率：選取硫酸奎寧(qy＝54.0％)為標(biāo)準(zhǔn)物，在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下(350nm)，獲得吸光度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05的標(biāo)樣和待測(cè)樣溶液，分別測(cè)其熒光強(qiáng)度，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)物和實(shí)施例2樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如圖8所示，分別將圖中標(biāo)準(zhǔn)物和實(shí)施例2樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率帶入下列方程：

qyx＝qyst(gx/gst)(ηx/ηst)²

qyx和qyst:樣品和標(biāo)準(zhǔn)物的熒光量子產(chǎn)率；

gx和gst:樣品和標(biāo)準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率；

ηx和ηst：樣品和標(biāo)準(zhǔn)物溶液所用溶劑的折射率；

經(jīng)計(jì)算，獲得了較高熒光量子產(chǎn)率的碳量子點(diǎn)，為32.9％。

試驗(yàn)例3

將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的碳點(diǎn)進(jìn)行氮摻雜熒光碳量子點(diǎn)的ph穩(wěn)定性測(cè)試：調(diào)節(jié)ph所用的試劑為naoh和hcl稀溶液，取2.0ml濃度為4mg/ml的碳點(diǎn)溶液，用naoh和hcl調(diào)節(jié)ph，分別為1、3、5、7、9、11、13，溶液定容至20ml，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，在ph為5～9的范圍內(nèi)，碳點(diǎn)溶液展示了良好的熒光穩(wěn)定性，證明其適用于體外成像。

試驗(yàn)例4

將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的碳點(diǎn)進(jìn)行mtt比色法毒性測(cè)試，步驟如下：(1)將細(xì)胞在5％co2，37℃孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，在每孔加入待測(cè)溶液，使待測(cè)溶液在每孔的濃度梯度分別為0、20、100、300、500、1000μg/ml^-1；(2)24h過后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；(3)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；(4)每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀od490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

從圖10實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率雖有所下降，但在濃度1000μgml^-1培養(yǎng)48h的條件下，細(xì)胞存活率為80％，證明本發(fā)明的氮摻雜的碳量子點(diǎn)基本適合于活體細(xì)胞成像的研究。

試驗(yàn)例5

將實(shí)施例2中制備的氮摻雜的熒光碳量子點(diǎn)在豆芽中進(jìn)行應(yīng)用。將準(zhǔn)備好的黃豆浸泡在水中2h，待黃豆吸水至飽滿時(shí)放入塑料制籃子里培養(yǎng)，每天分早中晚給黃豆?jié)菜帘砻鏉駶?rùn)，待黃豆芽長(zhǎng)至約2cm長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)入濃度為4mg/l的樣品溶液中培養(yǎng)約6h(2cm長(zhǎng)豆芽浸沒溶液中約1cm)。培養(yǎng)結(jié)束后取出豆芽，用去離子水清洗三次，將豆芽放在紫外燈下觀察其熒光標(biāo)記情況。如圖11所示，在365nm的紫外燈照射下，黃豆芽的胚根上發(fā)出了藍(lán)色熒光，取得了較好的熒光標(biāo)記效果。

試驗(yàn)例6

將實(shí)施例2中制備的氮摻雜的熒光碳量子點(diǎn)在宮頸癌細(xì)胞(hela)中進(jìn)行應(yīng)用。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100μg·ml^-1碳點(diǎn)溶液，將培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。取出，后用磷酸緩沖溶液清洗三次，分別在405nm、488nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行激光共聚焦成像。如圖12所示，細(xì)胞的熒光標(biāo)記效果較好，本實(shí)驗(yàn)的碳點(diǎn)在癌細(xì)胞中的熒光標(biāo)記取得了較好的效果，為下一步的實(shí)驗(yàn)做好一個(gè)良好的鋪墊。

本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，如果對(duì)本發(fā)明的各種改動(dòng)或變形不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若這些改動(dòng)和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變形。