本發(fā)明涉及生物樣本檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合抗氧化劑及其制法，和一種抗氧化取樣管及其用途。
背景技術(shù)：
血液標本的采集和血清的分離在臨床生化檢測中是至關(guān)重要的，同時也是造成實驗室操作人員實驗室“感染”的多發(fā)地段。真空采血管是近幾年應(yīng)用于臨床的檢驗采血新產(chǎn)品，真空采血管在生產(chǎn)過程中預(yù)置了一定量的負壓，真空采血管按標本采集類型分類可分為血清管、血漿管和全血管3類。根據(jù)不同的用途,不同真空采血管內(nèi)添加了不同的添加劑。添加劑包括多種成分,如抗凝劑、促凝劑、緩沖劑、保護劑、分離膠等。其品種、性能、濃度直接影響血樣的性狀和檢測結(jié)果。試管管帽標有不同的色碼，適于不同的檢驗項目；真空試管為密閉式；真空采血管分別為有刻度的，紅，紫，藍，黑，綠等不同顏色管帽的試管。經(jīng)過多年的應(yīng)用推廣，由于其潔凈安全、簡單快捷、準確可靠、安全有效等顯著優(yōu)點，正逐漸代替了傳統(tǒng)的注射器采血方法。
然而，在臨床使用過程中,有一些問題的發(fā)生，影響了標本的順利采集。在不同性能的采血管中，都不可避免的混入空氣，這樣一方面會使取樣量不精確，另外又容易使管中樣本氧化。氧化反應(yīng)過程可以產(chǎn)生游離自由基，然后這些游離自由基可以啟動連鎖反應(yīng)，當這些連鎖反應(yīng)發(fā)生在細胞中時，便會造成細胞的損傷或者凋亡。此外，在采集其他臨床標本如體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等過程中，同樣會發(fā)生采集樣本被氧化的現(xiàn)象，嚴重影響了臨床數(shù)據(jù)的準確性。
針對上述文本，專利申請?zhí)枮?01510593451.5公開為一種提高樣本檢測精度和準確性的生物樣本穩(wěn)定試劑，主要由dna酶抑制劑、rna酶抑制劑、固定劑/防腐劑、代謝抑制劑、抗氧化劑、三線態(tài)淬滅劑以及再水化強化劑制成，生物樣本穩(wěn)定試劑使用大量抑制劑、抗菌劑、防腐劑和能量來源的atp混合在一起作為保存基質(zhì)，以此提高樣本的穩(wěn)定，其適合更長時間的保存試劑。然而其添加的抑制劑、抗菌劑等會影響樣本的準確度，如對唾液、尿液等樣本中本身含有大量菌群，該試劑同樣會對樣本的自帶菌群帶來影響，從而影響樣本的檢測數(shù)據(jù)。
申請人結(jié)合試劑臨床取樣環(huán)境和取樣流程，研制出一種主要具有抗氧化作用，配方簡單有效的復(fù)合抗氧化劑以及使用該復(fù)合抗氧化劑的采樣裝置。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提出一種復(fù)合抗氧化劑，可以防止樣本被氧化，使臨床數(shù)據(jù)更為精準，減少誤差。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合抗氧化采樣裝置，即實現(xiàn)精確標記取樣量，又避免樣本氧化缺陷。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種復(fù)合抗氧化劑，所述復(fù)合抗氧化劑至少包括下述濃度的組分：
0.01～1mol/l的由弱酸及其共軛酸鹽組合成的緩沖溶液；
1～200μmol/l的含有至少兩種受阻酚類抗氧化劑的溶液；以及
1～100μmol/l含有至少一種抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液。
在進一步的方案中，所述復(fù)合抗氧化劑還包括下述濃度的組分：
0.1～10mmol/l的含有ca2螯合劑的溶液；以及
1-100mmol/l的細胞保護劑溶液。
在一個具體的優(yōu)選方案中，所述緩沖溶液選自檸檬酸鹽溶液或磷酸鹽溶液；所述受阻酚類抗氧化劑選自bht、bha、tbhq、pg、生素c、維生素e和多酚；所述抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)選自雙嘧達莫和普羅布考。
在另一個具體的優(yōu)選方案中，所述ca2螯合劑為edta及其二鈉鹽；所述細胞保護劑為茶堿。
進一步的，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.03～5mol/l的緩沖溶液；
5～100μmol/l的含有兩種的受阻酚類抗氧化劑的溶液；
0.5～5mmol/l的含ca2螯合劑的溶液；
5～40μmol/l的含抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液；以及
3～30mmol/l的含細胞保護劑的溶液。
本發(fā)明還公開了一個復(fù)合抗氧化劑的優(yōu)選方案，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05～2mol/l檸檬酸鈉溶液、5～15μmol/lbht溶液、10～25μmol/l維生素e溶液、0.8～1.5mmol/ledta溶液、10～25μmol/l雙嘧達莫溶液以及10～20mmol/l茶堿溶液。
進一步的，所述復(fù)合抗氧化劑中組分溶液濃度為：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液、1mmol/ledta溶液、20μmol/l雙嘧達莫溶液以及15mmol/l茶堿溶液。
本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑中，檸檬酸鈉溶液為緩沖溶液，可降低樣本ph變動幅度，同時其與edta協(xié)同除具有抗凝作用外，還具有一定的抗原修復(fù)作用，適用于細胞和組織的采取；bht和維生素e復(fù)用具有更佳的抗氧化效果，提高樣本穩(wěn)定性，而檸檬酸鈉和edta均有抗氧化作用，四者共同使用具有抗氧化協(xié)同增效作用。
雙嘧達莫(dipyridamole，又名雙嘧啶胺醇)，可抑制血小板第一相和第二相聚集，可逆性抑制磷酸二酯酶，減少血小板中的camp分解；雙嘧達莫可阻止氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的形成，有效發(fā)揮抗氧化作用，且抑制組織樣本中腫瘤壞死因子及白介素等炎癥因子的表達，提高組織樣本穩(wěn)定性；其與其他抗氧化劑協(xié)同使用，進一步提高抗氧化效果。此外，茶堿有保護肥大細胞膜、抑制炎性介質(zhì)釋放的作用，穩(wěn)定樣本細胞。
在又一個優(yōu)選方案中，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05～2mol/l檸檬酸鈉溶液、5～15μmol/lbht溶液、10～25μmol/l維生素e溶液、0.8～1.5mmol/ledta溶液、10～25μmol/l普羅布考溶液以及10～20mmol/l茶堿溶液。
其中的普羅布考(probucol，又名丙丁酚)具有較強的抗氧化作用，其抗氧化作用主要來自氧離子捕捉和斷鏈抗氧化的特性，其含有的酚羥基有效降低血漿氧自由基濃度，抑制ox-ldl的形成。
本發(fā)明另一方面還提供了上述復(fù)合抗氧化劑的制法，所述制法包括：
步驟1、分別配制所述濃度的檸檬酸鈉溶液、edta溶液、bht溶液、維生素e溶液、雙嘧達莫溶液以及茶堿溶液；
步驟2、將配置好的上述各種溶液混合均勻，即得所述復(fù)合抗氧化劑。
在進一步具體的步驟1中，配制各溶液的方法具體為：
將檸檬酸鹽加入蒸餾水配置成所述濃度的緩沖溶液；
將na2h2y·2h2o置于燒杯中加蒸餾水，微熱溶解后進行稀釋，搖勻然后用caco3作為基準物進行標定，即得所述濃度的edta溶液；
將bht標準物質(zhì)溶于甲醇溶液中，定容，得到所述濃度的bht溶液；
將維生素e置于棕色容量瓶中，用乙烷定容，即得維生素e溶液，避光保存；
取粉狀雙嘧達莫置于容器，加0.01mol/l鹽酸溶液適量，溶解完全后，繼續(xù)加入0.01mol/l鹽酸溶液定量稀釋制成所述濃度的雙嘧達莫溶液；
將茶堿加水微熱溶解后進行稀釋成所述濃度，搖勻，即得茶堿溶液。
更進一步的為使復(fù)合抗氧化溶液更好的涂布在采樣裝置內(nèi)壁上，形成三維空間結(jié)構(gòu)，從而使復(fù)合抗氧化劑與檢測樣品更充分結(jié)合，所述步驟2中混合各種溶液時，還加入1～50g/l可溶性的增粘劑，所述增粘劑選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、瓊脂糖和果膠酸鈣中的一種或幾種。
本發(fā)明還提供了一種抗氧化采樣裝置，其為帶蓋體的封閉式容器，其中上述的抗氧化劑容納在所述容器中。
在進一步的方案中，所述容器為管狀或袋狀，所述抗氧化劑涂覆于所述管狀容器或袋裝容器的內(nèi)壁；或者涂覆于所述管狀容器或袋狀容器的內(nèi)壁和蓋體內(nèi)壁上。
為合理設(shè)置復(fù)合抗氧化劑的涂布量，所述涂覆面積不少于內(nèi)壁總面積的3/4。
在一個具體的優(yōu)選方案中，所述抗氧化采樣裝置為采樣管，所述制備方法包括：將抗氧化劑溶液倒入管狀容器內(nèi)，蓋上密封蓋，翻轉(zhuǎn)晃蕩，直至所述管狀容器內(nèi)壁均勻掛漿，隨后將多余溶液倒出，即用或者管壁溶液干燥后待用。
本發(fā)明再進一步公開了本發(fā)明抗氧化采集裝置在生化檢驗、免疫檢驗、微生物檢驗、血液檢驗以及寄生蟲檢驗中的用途。
具體的，該抗氧化采樣裝置在血液、血清、血漿、洗嗽液、汗液、粘液、陰道分泌物、毛發(fā)、體腔的體液、細胞、活組織取樣中的用途。
本發(fā)明的復(fù)合抗氧化劑的應(yīng)用范圍廣，可用于生化檢驗、免疫檢驗、微生物檢驗、血液檢驗以及寄生蟲檢驗，其適應(yīng)性好。該符合抗氧化劑通過多種抗氧化劑復(fù)合發(fā)揮協(xié)同增效作用，防止樣本被氧化，穩(wěn)定樣本濃度，提高樣品檢測精度和準確性。本發(fā)明采用的抗氧化采樣裝置通過復(fù)合抗氧化劑在其內(nèi)壁涂覆，使抗氧化劑與檢測樣本接觸更充分，更好的溶于檢測樣本中，提高抗氧化劑效果；且該涂布方法直接在現(xiàn)有的采樣裝置(如采樣管和采樣袋)中使用，操作簡單。
具體實施方式
本發(fā)明實施例公開了一種復(fù)合抗氧化劑及抗氧化采樣裝置。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)。特別需要指出的是，所有類似的替換替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的復(fù)合抗氧化劑、其制備方法以及抗氧化采樣裝置、其制備方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的抗氧化劑和采樣裝置進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案。
一種復(fù)合抗氧化劑，所述復(fù)合抗氧化劑至少包括下述濃度的組分：
0.01～1mol/l的由弱酸及其共軛酸鹽組合成的緩沖溶液；
1～200μmol/l的含有至少兩種受阻酚類抗氧化劑的溶液；以及
1～100μmol/l含有至少一種抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液。
本發(fā)明抗氧化劑主要由多種抗氧化劑復(fù)合而成，其中受阻酚類抗氧化劑和天然抗氧化劑復(fù)合具有協(xié)同增效作用，添加抑制氧化低密度脂蛋白形成的抗氧化物質(zhì)針對性強且更為有效；該復(fù)合抗氧化劑還通過緩沖溶液校正樣本的ph，以此進一步穩(wěn)定樣本。
在一些實施例中，所述緩沖溶液為ph6～10的緩沖溶液，可以為有機緩沖溶液和/或無極緩沖溶液；在更優(yōu)選的實施例中，緩沖溶液具體選自檸檬酸鹽溶液或磷酸鹽溶液。
所述受阻酚類抗氧化劑作為主抗氧化劑，是一類在苯環(huán)上羥基的一側(cè)或兩側(cè)有取代基的化合物。由于羥基受到空間障礙，h原子容易從分子脫落下來，與過氧化自由基、烷氧自由基、羥自由基等結(jié)合使之失去活性，從而使熱氧老化的鏈反應(yīng)終止。在一些具體實施例中，所述受阻酚類抗氧化劑選自bht、bha、tbhq、pg、維生素c、維生素e和多酚。在一些更優(yōu)選的實施例中，bht作為主抗氧化劑，維生素e作為輔助抗氧化劑，將兩者并用，配成有效的復(fù)合穩(wěn)定劑。
在一些實施例中，所述抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)選自雙嘧達莫和普羅布考。這兩者藥物具有較強的抗氧化作用，其含有的酚羥基有效降低血漿氧自由基濃度，抑制ox-ldl的形成。
本發(fā)明另一個技術(shù)方案中，在上述方案的基礎(chǔ)上，所述復(fù)合抗氧化劑還包括下述濃度的組分：
0.1～10mmol/l的含有ca2螯合劑的溶液；以及
1-100mmol/l的細胞保護劑溶液。
在一些實施例中，ca2螯合劑為edta及其二鈉鹽；所述細胞保護劑為茶堿。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的配方進行說明。
實施例1
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液、1mmol/ledta溶液、20μmol/l雙嘧達莫溶液以及15mmol/l茶堿溶液。
實施例2
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05mol/l檸檬酸鈉溶液、5μmol/lbht溶液、10μmol/l維生素e溶液、0.8mmol/ledta溶液、10μmol/l雙嘧達莫溶液以及10mmol/l茶堿溶液。
實施例3
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
2mol/l檸檬酸鈉溶液、15μmol/lbht溶液、25μmol/l維生素e溶液、1.5mmol/ledta溶液、25μmol/l雙嘧達莫溶液以及20mmol/l茶堿溶液。
實施例4
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05mol/l檸檬酸鈉溶液、5μmol/lbht溶液、10μmol/l維生素e溶液、0.8mmol/ledta溶液、10μmol/l普羅布考溶液以及10mmol/l茶堿溶液。
實施例5
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
2mol/l檸檬酸鈉溶液、15μmol/lbht溶液、25μmol/l維生素e溶液、1.5mmol/ledta溶液、25μmol/l普羅布考溶液以及20mmol/l茶堿溶液。
實施例6
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
5mol/l磷酸鹽溶液、50μmol/lbha溶液、50μmol/l維生素c溶液、5mmol/ledta溶液、40μmol/l普羅布考溶液以及30mmol/l茶堿溶液。
實施例7
0.03mol/l磷酸鹽溶液、3μmol/ltbhq溶液、2μmol/lbha溶液、0.5mmol/ledta溶液、5μmol/l雙嘧達莫溶液以及3mmol/l茶堿溶液。
實施例8
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液以及20μmol/l雙嘧達莫溶液。
實施例9
0.01mol/l硼酸鹽溶液、1μmol/lbht溶液、0.5μmol/lbha溶液、1μmol/l雙嘧達莫。
實施例10
1mol/l三羥甲基氨基甲烷溶液、110μmol/pg溶液、95μmol/l多酚溶液、100μmol/l雙嘧達莫。
第二方面，本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的制法將各類抗氧化劑和保護劑分別用溶劑配制成特定濃度的溶液，混合均勻，即可。
在一個具體的實施例中，所述制法包括下述步驟：
步驟1、分別配制所述濃度的檸檬酸鈉溶液、edta溶液、bht溶液、維生素e溶液、雙嘧達莫溶液以及茶堿溶液；
步驟1.1將檸檬酸鹽加入蒸餾水配置成所述濃度的緩沖溶液；
步驟1.2將na2h2y·2h2o置于燒杯中加蒸餾水，微熱溶解后進行稀釋，搖勻然后用caco3作為基準物進行標定，即得所述濃度的edta溶液；
步驟1.3將bht標準物質(zhì)溶于甲醇溶液中，定容，得到所述濃度的bht溶液；
步驟1.4將維生素e置于棕色容量瓶中，用乙烷定容，即得維生素e溶液，避光保存；
步驟1.5取粉狀雙嘧達莫置于容器，加0.01mol/l鹽酸溶液適量，溶解完全后，繼續(xù)加入0.01mol/l鹽酸溶液定量稀釋制成所述濃度的雙嘧達莫溶液；
步驟1.6將茶堿加水微熱溶解后進行稀釋成所述濃度，搖勻，即得茶堿溶液。
步驟2、將配置好的上述各種溶液混合均勻，即得所述復(fù)合抗氧化劑。
在另一個實施例中，為了使后續(xù)所述復(fù)合抗氧化劑涂布掛壁效果更佳，在上述步驟2中，混合各種溶液時，還加入1～50g/l可溶性的增粘劑，所述增粘劑選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、瓊脂糖和果膠酸鈣中的一種或幾種。在一些實施例中，增粘劑優(yōu)選為聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇6000。在實際情況中，具體的可溶性增粘劑的加入量根據(jù)復(fù)合抗氧化劑的濃度在上述范圍內(nèi)進行調(diào)整。聚乙烯吡咯烷酮具有一定的粘接性，極易溶于水及含鹵代烴類溶劑、醇類、胺類、硝基烷烴及低分子脂肪酸等；聚乙二醇是水溶性高分子，且與聚乙烯吡咯烷酮協(xié)同作為粘接劑，具有較合適的粘度，適應(yīng)于本發(fā)明所述采集裝置。
第三方面，本發(fā)明提供了一種供用于生化檢測樣本的復(fù)合抗氧化劑使用的抗氧化采集裝置，其為帶蓋體的封閉式容器，本發(fā)明所述的復(fù)合抗氧化劑容納在所述容器中。
本發(fā)明的采集裝置可以盛裝液態(tài)、固態(tài)或固液混合生化樣品的容器。一般的，可設(shè)計成采集管或者采集袋的形式。在一些實施例中，所述采集管采用玻璃或塑料制成；所述采集袋采用塑料制成。進一步優(yōu)選的，玻璃材質(zhì)為硅硼玻璃或石英玻璃；塑料材質(zhì)為pft、pbt或者pen等。采集管的蓋體為配套使用的膠塞、管蓋或者鋁塑膜，可以為插入式或者旋擰式的，實現(xiàn)密封目的。在一些實施例中，本發(fā)明使用的采樣裝置為現(xiàn)有的真空采血管。
在一些實施例中，所述復(fù)合抗氧化劑涂覆于所述管狀容器或袋裝容器的內(nèi)壁；或者涂覆于所述管狀容器或袋狀容器的內(nèi)壁和蓋體內(nèi)壁上。
在一些實施例中，所述涂覆面積不少于內(nèi)壁總面積的3/4；在一個優(yōu)選的實施例中，所述涂覆面積與容器內(nèi)壁面積相等；或者所述涂覆面積與容器內(nèi)壁面積和蓋體內(nèi)壁面積之和相等；這兩種情況都屬于完全涂覆；形成三維空間結(jié)構(gòu)，在加入生化檢測樣本時能夠與復(fù)合抗氧化劑更充分的結(jié)合。
第四方面，本發(fā)明用于生化檢測標本的抗氧化采樣裝置的制備方法大致為：直接將復(fù)合抗氧化劑倒入容器中，翻轉(zhuǎn)晃蕩，使內(nèi)壁均勻充分覆蓋復(fù)合抗氧化劑，將多余的復(fù)合抗氧化劑倒出即可。
在一個實施例中，所述抗氧化采樣裝置為采樣管，所述制備方法包括：將復(fù)合抗氧化劑溶液倒入管狀容器內(nèi)，蓋上密封蓋，翻轉(zhuǎn)晃蕩，直至所述管狀容器內(nèi)壁均勻掛漿，隨后將多余溶液倒出，即用或者管壁溶液干燥后待用。其中干燥的方式可以室溫下空氣干燥，或是適當高溫下空氣干燥，或是真空干燥，或是其他。
第五方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化采樣裝置的用途，其廣泛應(yīng)用于生化檢驗、免疫檢驗、微生物檢驗、血液檢驗以及寄生蟲檢驗。在一些實施例中，該抗氧化采樣裝置用在血液、血清、血漿、洗嗽液、汗液、粘液、陰道分泌物、毛發(fā)、體腔的體液、細胞、活組織取樣中。
下面針對本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的抗氧化能力作出相關(guān)的抗氧化性能試驗，并借此驗證最佳配方的抗氧化性能。首先設(shè)置一組對照實施例：
對照實施例1
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液以及20μmol/l維生素e溶液。
試驗例1添加不同配方的復(fù)合抗氧化劑的血液抗氧化活性測定
將添加抗氧化劑的血液作為試驗對象，具體方法如下。
試驗兔子若干只，靜脈采血，每只兔子所采集的血液分成7組，其中6組分別放置加入有3ml本發(fā)明實施例1、實施例2、實施例4、實施例8、實施例10以及對照實施例1的復(fù)合抗氧化劑，1組作為空白對照組；每個組別放入5ml血液，混合均勻，存放于室溫下或4℃環(huán)境中。分別在24小時后以及5天后，取血液，靜置或置37℃環(huán)境中促其凝固，待血液凝固后，將其平衡后離心(一般為3000rpm，離心5～10min)，得到的上清液即為血清。
1、dpph自由基清除能力的測定：
量取7組實驗組的血清1ml于試管中，加入0.4mmol/l的dpph自由基溶液(用無水乙醇配制)0.2ml和2.0ml的蒸餾水，混勻反應(yīng)體系后，將其置于常溫下30min后于517nm波長處測定各個管的吸光度a1。用相同體積的無水乙醇代替dpph溶液為空白組，記為a2；用相同體積的蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，記為a0。所有測定值均為三次結(jié)果的平均值，根據(jù)以下公式計算自由基的清除率。
式中：a0為對照試驗(水代樣品溶液)的吸光度；a1為樣品試驗的吸光度；a2為樣品干擾試驗(無水乙醇代dpph溶液)的吸光度。
2、羥自由基(·oh)清除能力測定：
采用鄰二氮菲法。準確量取0.75mmol/l的鄰二氮菲溶液1.0ml置于干凈的試管中，再依次加入ph為7.4的pbs緩沖液2.0ml以及蒸餾水1.0ml，混勻反應(yīng)體系，加入1.0ml的0.75mmol/lfeso4溶液，然后用0.12％的雙氧水(現(xiàn)配現(xiàn)用)1.0ml啟動反應(yīng)，立刻震蕩混和均勻，記為ap；用同體積的蒸餾水代替0.12％的雙氧水，其余的條件均同ap處理方法，記為ab；用相同體積的7組實驗組的樣品溶液代替1.0ml的蒸餾水，其余條件均同ap處理方法，記為as。三個管ap、ab、as置于37℃水浴鍋中保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水調(diào)零，在波長為536nm的條件下測定各個管的吸光度，并將測得的吸光值代入到以下公式中計算羥自由基的清除率。
式中：ap為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mllfeso4+1mlh2o2+1mlh2o的吸光值；ab為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mllfeso4+2mllh2o的吸光值；as為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mlfeso4+1mlh2o2+1ml樣品溶液的吸光值。
3、超氧陰離子(o2-·)清除率的測定：
取4.5ml、0.5mol/l、ph＝8.2的tris-hcl緩沖液于干凈的試管中，將其置于25℃的水浴鍋中保持溫度20min，然后向每個管內(nèi)加入1ml的7組實驗組的血清，后準確加入同樣經(jīng)25℃水浴預(yù)熱后的2.5mmol/l鄰苯三酚溶液0.4ml，混合均勻后置于25℃水浴鍋中，準確反應(yīng)4min后立即加入1ml，8mol/l的hcl以終止該氧化反應(yīng)，以蒸餾水調(diào)零，于320nm波長處測定各個管內(nèi)液體的吸光度，記為a樣；空白對照組以相同體積的上述tris-hcl緩沖液代替樣品溶液，其余條件均同樣品管處理方法，其吸光度記為a空。每個試管做三個平行管，取平均值，并將所得到的最終吸光值代入到以下公式中計算超氧陰離子的清除率。
式中：a空為空白對照組溶液的吸光值；a樣為樣品溶液的吸光值。
4、金屬離子(fe2+)螯合能力的比較：
分別取1ml的7組實驗組的血清于試管中，依次準確加入50μl的2.0mmol/l的氯化亞鐵溶液，200μl的5.0mmol/l的菲咯嗪溶液以及2.75ml的蒸餾水。振蕩混和均勻反應(yīng)體系，然后將其置于室溫下保存10min以后，以蒸餾水調(diào)零，于562nm的波長處測定各個管的吸光度，記為a1；對照試驗以相同體積的蒸餾水代替樣品血溶液，其余條件均同樣品管處理方法，其吸光度為a0；樣品干擾試驗以相同體積的蒸餾水代替氯化亞鐵溶液，其余條件均同樣品管，其吸光度為a2。并將所測得的吸光度值取平均值后代入到以下公式中計算鐵離子的螯合率。
式中：a0為對照試驗(水代樣品)管的吸光度；a1為樣品試驗管的吸光度；a2為樣品干擾試驗(水代氯化亞鐵)管的吸光度。
上述試驗結(jié)果見表1。
表1不同配方的抗氧化采樣管對血液組分抗氧化活性的影響
由表1可知，實施例1-10的復(fù)合抗氧化劑具有良好的抗氧化性能，其中實施例1配方的復(fù)合抗氧化劑具有最佳抗氧化性能，其次是實施例2、實施例4。實施例1和實施例2比對，表明實施例1配方用量比更為優(yōu)選；實施例1和實施例8比較可知，再添加的edta和茶堿可提高抗氧化能力。實施例8和對照實施例1比較可知，添加雙嘧達莫的抗氧化劑抗氧化能力更佳。
試驗例2不同配方的復(fù)合抗氧化劑采集的dna樣品的穩(wěn)定性隨時間的變化
對同一合成的目標dna樣品(320bp)，設(shè)置14組，其中12組為加入復(fù)合抗氧化劑的試驗組，2組為對照組。
其中6組試驗組分別與水按體積比5:0.1加入實施例1、實施例2、實施例4、實施例9、實施例10和對照實施例1的復(fù)合抗氧化劑備用；目標dna(320對堿基對)，無菌去離子水溶解，加入上述備用的復(fù)合抗氧化劑溶液，再加dna酶i至終量為0.1u，4℃下冷藏24小時。1組對照組：目標dna(4320對堿基對)，無菌去離子水溶解，加入dna酶i至終量為0.1u，4℃冷藏24小時。
另其中6組試驗組分別與水按體積比5:0.1加入實施例1、實施例2、實施例4、實施例9、實施例10和對照實施例1的復(fù)合抗氧化劑備用；目標dna(320對堿基對)，無菌去離子水溶解，加入上述備用的復(fù)合抗氧化劑溶液，再加dna酶i至終量為0.1u，4℃下冷藏5天。1組對照組：目標dna(320對堿基對)，無菌去離子水溶解，加入dna酶i至終量為0.1u，4℃冷藏5天。
將不同試驗組處理后的目標dna進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖含量為2％，著色劑染色，記錄結(jié)果。
結(jié)果依據(jù)dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，在電場中向正極移動。結(jié)果為：其中2組對照組分布有兩個條帶；2組對照組實施例1的試驗組分布有兩個條帶；10組實施例的試驗組僅一個條帶；說明本發(fā)明的技術(shù)方案可在室溫下將目標dna進行穩(wěn)定保存，且保存時間長至5天。
以上所述的實施方式，并不構(gòu)成對該技術(shù)方案保護范圍的限定。任何在上述實施方式的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在該技術(shù)方案的保護范圍之內(nèi)。