本發(fā)明屬于熒光探針檢測，具體涉及一種特異性檢測硼化物尤其是bpa的熒光探針的制備方法、應(yīng)用及比率熒光分析方法。

背景技術(shù)：

1、硼酸化合物在有機化學和其他領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用，是現(xiàn)代合成有機化學中最有用的試劑之一。硼酸化合物還可作為硼中子俘獲療法(bnct)的有效藥劑，該療法是利用外部照射的熱中子與硼(10b)核(即我們所說的α射線)和鋰核反應(yīng)產(chǎn)生的高線性能量轉(zhuǎn)移(let)輻射來治療癌癥。2020年，日本開發(fā)出了一種可被腫瘤細胞吸收的藥物，即4-硼-l-苯丙氨酸(bpa)藥物，目前正以borofalan()的名稱在市場上銷售，用于治療局部晚期或局部復發(fā)的不可切除的頭頸部癌癥?？紤]到bnct的治療機制，輸送到腫瘤細胞中的10b濃度的大小會直接影響癌癥的預后，因此在臨床中必須對10b進行監(jiān)測，以估計注射bpa期間腫瘤中10b的濃度。

2、目前檢測細胞中bpa最常用方法是電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(icp-oes)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(icp-ms)，這些方法需要對樣品進行灰化，不適合確定硼在細胞內(nèi)的定位。雖然還有其他評估細胞內(nèi)硼定位的方法，如二次離子質(zhì)譜成像法(sims)和pet成像法，但這些方法通常過于昂貴，而且需要復雜的預處理。與上述方法相比，熒光探針法因其操作簡單、快速分析、低成本以及無創(chuàng)檢測而備受歡迎。

3、因此，開發(fā)快速、靈敏、專一檢測bpa的方法在生物科學領(lǐng)域具有重要的研究意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種簡單、高效的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，能夠用于檢測硼化物，尤其是檢測bpa，解決人體注射bpa藥物后通過尿液代謝的bpa檢測時間長、檢測范圍窄等問題，在環(huán)境科學和生命科學領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供具有如下所示的結(jié)構(gòu)式(ⅰ)的2-(2-羥苯基)苯并咪唑的應(yīng)用。

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5、本發(fā)明提供一種2-(2-羥苯基)苯并咪唑的制備方法，包括以下步驟：鄰苯二胺與水楊醛在含有二氧化硅的乙醇溶液中進行回流反應(yīng)得到所述2-(2-羥苯基)苯并咪唑。

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7、所述鄰苯二胺、水楊醛和二氧化硅的摩爾比為1:0.8-1.5:0.5-1，優(yōu)選為1:1:0.82。

8、所述乙醇溶液優(yōu)選為無水乙醇。

9、在室溫下回流反應(yīng)24小時，優(yōu)選25℃回流反應(yīng)24小時。

10、反應(yīng)結(jié)束后，分離出熒光探針2-(2-羥苯基)苯并咪唑(hbi)的沉淀物，經(jīng)過洗滌3次實現(xiàn)純化，洗滌溶劑為乙醇溶液，優(yōu)選為無水乙醇。

11、本發(fā)明提供的2-(2-羥苯基)苯并咪唑(hbi)通過激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(esipt)，產(chǎn)生互變異構(gòu)體，發(fā)出具有大的斯托克斯位移的特征熒光。hbi在與4-硼-l-苯丙氨酸(bpa)結(jié)合后，自身的esipt機制被破壞，出現(xiàn)熒光藍移的線性，作為bpa檢測用熒光探針，實現(xiàn)bpa的“比率型”熒光檢測分析，并且熒光量子產(chǎn)率高、響應(yīng)快速、光穩(wěn)定性好、選擇性高、抗干擾性能強。本發(fā)明提供的hbi與bpa結(jié)合后產(chǎn)生的優(yōu)異的熒光性能，證實hbi可用于硼化物的檢測，尤其是bpa的檢測。以hbi作為熒光探針的檢測方法具有無創(chuàng)、操作簡單、成本低廉、快速高效等產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，為硼化物尤其是bpa的檢測提供新的檢測探針和檢測方法，在環(huán)境科學和生命科學領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。

12、本發(fā)明提供2-(2-羥苯基)苯并咪唑(hbi)在硼化物檢測用探針中的應(yīng)用，尤其是作為4-硼-l-苯丙氨酸(bpa)檢測用探針的應(yīng)用，實現(xiàn)比率熒光分析的硼化物檢測。含有2-(2-羥苯基)苯并咪唑的檢測用探針，還可用于制備硼化物尤其是bpa檢測用試劑或元件，根據(jù)具體檢測場景的要求而靈活設(shè)計試劑或元件，試劑可以是現(xiàn)場配置的含hbi探針的溶液，也可以是已經(jīng)配置好的含hbi探針的儲備溶液，元件可以是負載有hbi探針的各種形式的載體或裝置，包括但不限于探針、磁珠、面板、芯片、管道、通路等，滿足檢測的即時性、準確性、簡便性、可操作性等，滿足產(chǎn)業(yè)檢測需求，利于產(chǎn)業(yè)推廣應(yīng)用。

13、本發(fā)明提供一種檢測硼化物的比率熒光分析方法，包括以下步驟：以2-(2-羥苯基)苯并咪唑為探針，與待測樣品混合形成檢測體系，記錄2-(2-羥苯基)苯并咪唑的372nm熒光強度與445nm熒光強度的比值，進行樣品中硼化物濃度的定性和/或定量測定。

14、本發(fā)明以2-(2-羥苯基)苯并咪唑為探針的比率熒光分析方法，具有光穩(wěn)定性好、響應(yīng)快速、重現(xiàn)性好、回收率高、選擇性和抗干擾能力強等諸多方法學特性，以硼化物濃度和2-(2-羥苯基)苯并咪唑的372nm熒光強度與445nm熒光強度的比值分別為橫縱坐標，采用外標法、內(nèi)標法或標準加入法進行樣品中硼化物濃度進行定性和/或定量測定，優(yōu)選采用外標法或標準加入法進行樣品中硼化物濃度進行定性和/或定量測定，其中，外標法有標準曲線法和直接比較法。如本發(fā)明實施方式，以硼化物濃度和2-(2-羥苯基)苯并咪唑的372nm熒光強度與445nm熒光強度的比值分別為橫縱坐標，繪制標準曲線，進行樣品中硼化物濃度的定性和/或定量測定。

15、所述檢測體系中含有有機溶劑，包括但不限于甲苯、二氯甲烷、四氫呋喃、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈和二甲基亞砜中一種或多種的組合，優(yōu)選二甲基亞砜。

16、所述檢測體系中還含有緩沖溶液，包括但不限于醋酸-醋酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液、氨-氯化銨緩沖溶液等，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖溶液，更優(yōu)選為pbs緩沖液。檢測體系中加入緩沖溶液，用于調(diào)整檢測體系的ph值，滿足待檢測樣品的檢測環(huán)境要求。根據(jù)不同的待檢測樣品，選擇使用不同的緩沖溶液，穩(wěn)定檢測環(huán)境和目標化合物的同時不影響后續(xù)檢測，即添加緩沖溶液的檢測體系，模擬待檢樣品環(huán)境，維持待檢樣品和目標化合物的穩(wěn)定，保證結(jié)果的可靠性、準確性。如本發(fā)明實施方式，檢測尿液樣品時使用含pbs緩沖溶液的二甲基亞砜(dmso)檢測體系，其ph值在7.4左右，模擬尿液環(huán)境，盡量避免檢測過程待檢樣品環(huán)境的改變對目標化合物檢測的影響，保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

17、所述檢測體系中有機溶劑的體積含量為0.01％-99.9％；優(yōu)選為40％-90％，進一步優(yōu)選為55％-80％，進一步優(yōu)選為50％-75％。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方式中，檢測體系中有機溶劑的體積含量為50％。

18、所述硼化物為有機硼化物和/或金屬硼化合物，有機硼化物包括但不限于硼酸及其衍生物、硼酸酯及其衍生物、硼醇及其衍生物、硼醛及其衍生物、硼酰胺及其衍生物、硼酸鹽及其衍生物、硼雜環(huán)化合物及其衍生物中一種或多種的組合，優(yōu)選為4-硼-l-苯丙氨酸(bpa)和/或苯硼酸。

19、所述檢測體系中，硼化物與2-(2-羥苯基)苯并咪唑的檢測反應(yīng)時間為1-20分鐘，優(yōu)選為5-15分鐘，進一步優(yōu)選為8-12分鐘，更優(yōu)選為10分鐘。

20、所述檢測體系中2-(2-羥苯基)苯并咪唑的濃度為10-50μm，優(yōu)選為15-25μm，更優(yōu)選為20μm，保證2-(2-羥苯基)苯并咪唑作為探針進行檢測所得結(jié)果的線性關(guān)系。如本發(fā)明實施方式，2-(2-羥苯基)苯并咪唑的濃度為20μm，含硼化合物的線性響應(yīng)范圍為0～220μm，檢出限為7.11μm。

21、所述樣品包括環(huán)境科學領(lǐng)域和生命科學領(lǐng)域中所有可采集的樣品，包括但不限于液態(tài)、固態(tài)、半固態(tài)等，如環(huán)境科學領(lǐng)域的水樣、土樣等，生命科學領(lǐng)域的尿樣、血樣、組織樣等。

22、本發(fā)明有益效果為：

23、本發(fā)明以2-(2-羥苯基)苯并咪唑(hbi)作為熒光探針，進行硼化物尤其是4-硼-l-苯丙氨酸(bpa)濃度的定性和/或定量檢測，具有以下優(yōu)勢：(1)hbi作為熒光探針，熒光量子產(chǎn)率高、響應(yīng)快速、光穩(wěn)定性好，實現(xiàn)對含硼化合物尤其是bpa的“比率型”熒光檢測；(2)選擇性強，抗金屬干擾能力強，可忽略金屬離子對檢測結(jié)果的影響；(3)線性響應(yīng)范圍寬0～220μm，線性關(guān)系良好，檢出限為7.11μm，靈敏度高；(4)檢測時間短，條件簡單，易操作，成本低，高效快速；試劑用量少，綠色環(huán)保；(5)應(yīng)用于生命科學領(lǐng)域，實現(xiàn)硼化物(如bpa)的無創(chuàng)檢測。