能量轉(zhuǎn)移增強(qiáng)熒光染料的制作方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及的化工領(lǐng)域，尤其涉及一種能量轉(zhuǎn)移的熒光染料的使用。發(fā)明背景
已經(jīng)開發(fā)了各種熒光染料標(biāo)記和檢測樣品中的組件。在一般情況下，優(yōu)選的熒光染料具有高的量子產(chǎn)率和使染料可被用來檢測被檢測成分的少量的大的消光系數(shù)。熒光染料最好還具有大的斯托克斯位移，因此，容易區(qū)別于用來激發(fā)光源的熒光發(fā)射染料。已開發(fā)的一類熒光染料的能量轉(zhuǎn)移熒光染料。在一般情況下，能量轉(zhuǎn)移的熒光染料包括一個(gè)供體熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)。在這些染料中，在彼此相鄰，并與正確的方向相對于彼此的位置時(shí)，供體和受體熒光團(tuán)，被吸收的能量從供體熒光團(tuán)的發(fā)射由受體熒光，導(dǎo)致受體熒光團(tuán)發(fā)出熒光。因此重要的是能夠有效地吸收激發(fā)能量的供體熒光團(tuán)的能量有效地轉(zhuǎn)移到受體熒光，激發(fā)態(tài)的供體熒光團(tuán)。
[0002]對于這些檢測方法中，理想的是同時(shí)采用一組中的兩個(gè)或更多個(gè)頻譜解析的熒光染料在同一時(shí)間，讓一個(gè)以上的目標(biāo)物質(zhì)的樣品中可檢測到。使用多種染料的樣品中的多個(gè)組件的同時(shí)檢測減少了所需的時(shí)間串行檢測樣品中的單個(gè)組件。在多基因座的DNA探針檢測的情況下，頻譜解析的多個(gè)熒光染料的使用所需要的反應(yīng)管的數(shù)量減少，從而簡化了實(shí)驗(yàn)協(xié)議和便于制造的特定應(yīng)用的試劑盒。在自動(dòng)DNA測序的情況下，頻譜解析的多個(gè)熒光染料的使用允許所有四種堿基在一個(gè)單一的線，從而增加數(shù)據(jù)吞吐量超過單色的方法和消除不確定性與車道間的電泳遷移率的變化的分析。
[0003]有與用于同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)物質(zhì)的樣品中獲得的一組熒光染料的一些困難，特別是對于需要電泳分離和治療用酶，例如，DNA測序分析。例如，每個(gè)組中的染料必須從其他染料光譜解析。這是很難找到一個(gè)收集染料的發(fā)射光譜分光，由于有機(jī)熒光染料的典型的發(fā)射帶的半寬度大約是4080納米(nm)的可用頻譜的寬度是有限的激發(fā)光源。如本文所用的術(shù)語“參考一組染料的光譜分辨率”表示染料的熒光發(fā)射帶足夠明顯的，即，足夠的非重疊的，該試劑各自的染料附著，例如多核苷酸，可以區(qū)分的基礎(chǔ)上，使用標(biāo)準(zhǔn)的光檢測系統(tǒng)由各自的染料產(chǎn)生的熒光信號，例如采用帶通濾波器及光電倍增管，電荷耦合器件和攝譜儀，或類似的系統(tǒng)。與使用相關(guān)的一組染料的另一個(gè)困難是，染料一般不具有相同的最大吸光度。當(dāng)染料的一組用于不具有相同的最大吸光度，創(chuàng)建一個(gè)權(quán)衡與提供多個(gè)光源，以激發(fā)每個(gè)在其最大吸光度的染料之間的較高的成本，較低的靈敏度每一種染料所產(chǎn)生的不興奮，其最大吸光度。
[0004]除外，電荷，分子大小和構(gòu)象的染料必須不會(huì)產(chǎn)生不利影響的片段的電泳遷移率。熒光染料也必須與用于創(chuàng)建或操作的片段，例如，DNA的合成的溶劑和試劑，緩沖液，酶聚合酶，連接酶的酶和類似的化學(xué)相容。
[0005]與當(dāng)前可用的若丹明染料，特別是在多重檢測方法的上下文相關(guān)聯(lián)的一個(gè)缺點(diǎn)，是若丹明染料的相對寬的發(fā)射光譜。這種廣泛的發(fā)射光譜限制之間的光譜分辨率光譜相鄰染料，使這種染料組合的多組分分析的困難。與當(dāng)前可用的若丹明染料的第二個(gè)缺點(diǎn)是它們的吸收光譜不匹配波長當(dāng)前可用的固態(tài)倍頻綠光二極管激光器，例如，固態(tài)釹YAG激光器，其中有一個(gè)在約532 nm的發(fā)射線。這是非常有利的，使用這樣的激光器，因?yàn)樗鼈兙哂芯o湊的尺寸，使用壽命長，電源使用效率。能量轉(zhuǎn)移的熒光染料具有一些功能，這使得他們有吸引力的同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)物質(zhì)的樣品中，如在DNA測序中使用。例如，一個(gè)單一的供體熒光團(tuán)可用于能量轉(zhuǎn)移的一組熒光染料，染料，使每個(gè)有較強(qiáng)的吸收，在一個(gè)共同的波長。然后，通過不同的受體熒光團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移染料，產(chǎn)生了一系列的能量轉(zhuǎn)移染料，熒光發(fā)射光譜解析可以。任何使用的熒光染料的檢測的靈敏度依賴于所產(chǎn)生的熒光染料的熒光信號的強(qiáng)度。因此，需要有很強(qiáng)的熒光信號的熒光染料。關(guān)于能量轉(zhuǎn)移熒光染料，這些染料的熒光信號的強(qiáng)度依賴于吸收的能量受體熒光的供體熒光團(tuán)的發(fā)射效率。反過來，這取決于多種變量，包括鄰近的供體熒光團(tuán)受體的熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)供體熒光團(tuán)的相對的方向。因此，需要的能量轉(zhuǎn)移的熒光染料中，供體和受體熒光團(tuán)之間的取向是這樣的供體和受體熒光團(tuán)之間的能量高效地傳遞。
[0006]本發(fā)明涉及的連接子連接的供體到受體的能量轉(zhuǎn)移染料的熒光染料染料。本發(fā)明還涉及具有增強(qiáng)的熒光能量轉(zhuǎn)移的熒光染料。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的染料的能量傳遞，使用的染料和試劑的方法，包括在其內(nèi)的染料和試劑和試劑盒的試劑。具體實(shí)施方法1、能量轉(zhuǎn)移本發(fā)明的染料鏈接器
本發(fā)明涉及新穎的連接子連接的供體到受體的能量轉(zhuǎn)移染料的熒光染料染料。本發(fā)明還涉及能量轉(zhuǎn)移的熒光染料，其中包括這些連接子。已發(fā)現(xiàn)在這些鏈接器以方便一個(gè)供體和受體的能量轉(zhuǎn)移染料的染料之間的能量有效地轉(zhuǎn)移。
[0007]2、本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料
在一般情況下，本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料包括供體染料吸收在第一波長的光，并發(fā)出響應(yīng)的激發(fā)能量，是能夠吸收激發(fā)能量供體染料發(fā)射的熒光的第二受體染料波長響應(yīng)和鏈接器重視捐助染料的受體染料。關(guān)于本文所提供的所有的分子結(jié)構(gòu)，它的目的是，這些分子結(jié)構(gòu)不僅包括精確的電子結(jié)構(gòu)，但還包括其所有的共振結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移的熒光染料的一類包括供體染料，咕噸類染料，受體染料和一個(gè)連接器，這是如本文所用，第I節(jié)中所述的連接子組的成員的成員咕噸染料包括所有的分子具有通式結(jié)構(gòu)。
[0009]如上所述，根據(jù)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料的第一類包括供體基團(tuán)，這是一個(gè)成員的咕噸類染料，因此具有咕噸環(huán)結(jié)構(gòu)為4的環(huán)的位置。在該類別中的染料受體染料是一種能夠吸收激發(fā)能量供體染料發(fā)射的熒光響應(yīng)的第二波長的染料，該染料。
[0010]根據(jù)本實(shí)施例中，供體可以是熒光素，若丹明或不對稱苯并類染料，這些染料每個(gè)會(huì)員提供了更廣泛的咕噸類染料的成員。咕噸染料的一般結(jié)構(gòu)式所示。具有一般咕噸，熒光素，若丹明，和非對稱苯并環(huán)結(jié)構(gòu)的，因?yàn)樗械娜玖隙紝⒙淙氲姆秶畠?nèi)的各種各樣的取代基，可被結(jié)合到這些不同類別的染料，這些染料中所示的取代基可以選自本發(fā)明。
[0011]這類接收器可以用在本實(shí)施例中的能量轉(zhuǎn)移熒光染料的染料的例子包括，但不限于，咕噸染料，花青染料，酞菁染料，方酸染料。這些染料的一般結(jié)構(gòu)中。這些染料中所示的取代基可以選自各種各樣的可摻入到這些不同類別的染料，因?yàn)樗械娜玖暇哂幸话愕墓緡?，熒光素，若丹明，不對稱苯并，花青，酞菁，方酸環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基取代的目的是屬于本發(fā)明的范圍。
[0012]另外，本發(fā)明涉及的第四類的能量轉(zhuǎn)移的熒光染料，其中供體染料是咕噸類染料的成員，和受體染料是咕噸，花青，酞菁或方酸菁類染料的成員。在該類別中的能量轉(zhuǎn)移的染料，優(yōu)選的是，供體染料的熒光素類的成員和受體染料發(fā)射最大值是大于約600nm和/或至少約100，最大發(fā)射納米大于供體染料的最大吸收。
[0013]本發(fā)明第四類染料表現(xiàn)出不尋常的大斯托克的變化，所測得的供體和受體的發(fā)射之間的吸光度的差異。此外，這些染料表現(xiàn)出有效的能量轉(zhuǎn)移，在該最小的供體熒光觀察。有趣的是，從供體到受體，在一些屬于這一類的染料，即使受體染料的吸收光譜不重疊的供體染料的發(fā)射光譜的能量轉(zhuǎn)移。
[0014]受體在本實(shí)施方式中可以使用的染料的例子包括，但不限于5 -羧基-X。
[0015]本實(shí)施例中的能量轉(zhuǎn)移染料還包括一個(gè)鏈接，供體到受體。該連接器用來連接供體到受體染料可以是任何連接器，根據(jù)所述第一和第二類的染料。然而，可以預(yù)見，備用鏈接器也可以使用在這個(gè)類染料。
[0016]本發(fā)明的上述的能量轉(zhuǎn)移染料的例子。值得注意的是，染料有5 -羧基熒光素供體染料，咕噸染料各種各樣的其他應(yīng)當(dāng)理解，可以容易地作為供體染料取代。還應(yīng)當(dāng)理解的是，各種各樣的其它咕噸染料，以及花青，酞菁，方酸染料可以很容易地為5 -羧基ROX和Cy5的受體基團(tuán)取代的，如上面已經(jīng)描述了，所有這些方面的變化落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的供體和受體染料。
[0017]在此實(shí)施例中的能量轉(zhuǎn)移染料表現(xiàn)出異常大的斯托克的變化，這使得這些染料特別適合于使用與染料具有較小的斯托克移的四種熒光DNA測序。3、本發(fā)明包括能源傳輸染料試劑
本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移熒光染料的熒光試劑。第III部分中更詳細(xì)地描述的，這些試劑可以用在各種各樣的方法，用于檢測樣品中的一個(gè)組成部分的存在。
[0018]本發(fā)明的熒光試劑包括的任何分子或材料，本發(fā)明的染料的能量傳遞，可以附加用于檢測基于熒光能量轉(zhuǎn)移染料的試劑的存在下。本發(fā)明的染料可以附著到形成的試劑的分子和材料的類型包括，但不限于蛋白質(zhì)，多肽，多糖，核苷酸，核苷，寡核苷酸，寡核苷酸類似物的(如肽核酸)，脂類，固相載體，有機(jī)和無機(jī)聚合物，以及它們的組合物，如染色體，細(xì)胞核，活細(xì)胞，如細(xì)菌等微生物，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織。
[0019]優(yōu)選的本發(fā)明的試劑類，核苷酸，核苷，寡核苷酸和寡核苷酸的類似物已被修改，以包括本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料。核苷酸和核苷類試劑的用途的例子包括，但不限于，標(biāo)記的寡核苷酸形成的酶促合成，例如，PCR擴(kuò)增，的桑格型寡核苷酸測序，缺口轉(zhuǎn)譯反應(yīng)中的上下文中使用的三磷酸核苷。寡核苷酸的試劑的用途的例子包括，但不限于，作為DNA測序的引物，PCR引物的寡核苷酸雜交探針并等。
[0020]一個(gè)特定的實(shí)施例中所用試劑標(biāo)記的核苷(NTP)，如胞嘧啶，腺苷，鳥苷，胸苷，能量傳遞的本發(fā)明的熒光染料標(biāo)記的。這些試劑可用于在多種涉及寡核苷酸合成的方法。另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施例中，標(biāo)記的核苷酸，例如，單-，雙-和三磷酸核苷的磷酸酯的。這些試劑包括，特別是脫氧核苷三磷酸，如三磷酸脫氧胞苷，脫氧腺苷三磷酸，三磷酸脫氧鳥苷，脫氧胸苷三磷酸，能量傳遞的本發(fā)明的熒光染料標(biāo)記的。也可以使用這些試劑，例如，作為聚合酶底物的染料標(biāo)記寡核苷酸的制備。這些試劑還包括標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸，另一個(gè)實(shí)施例的試劑，其中包括能量傳遞的本發(fā)明的熒光染料的寡核苷酸。
[0021 ] 本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料標(biāo)記的寡