一種溶酶體靶向次氯酸分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測細胞中溶酶體靶內(nèi)次氯酸的熒光探針及其制備方法和 應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧（ROS)是生物體內(nèi)在很多生理和病理過程起著非常重要作用的一些含氧自 由基(羥基自由基和超氧陰離子自由基等)和非自由基(次氯酸和次氯酸等)的總稱。生物體 內(nèi)在氧化應(yīng)激、炎癥等生理和病理情況下通過酶促和非酶促反應(yīng)產(chǎn)生各種R0S。近代的生物 醫(yī)學(xué)研究表明，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展和機體的老化有著密切的關(guān)系。次 氯酸，化學(xué)式為HC10,是一種不穩(wěn)定的弱酸，在純凈的水中通入氯氣即可形成次氯酸。在水 溶液中次氯酸可部分電離生成次氯酸根和氧離子，日常生活中次氯酸（一般是其鈉鹽）被 廣泛用作漂白劑、除臭劑和消毒劑。在生物細胞（如嗜中性白細胞）中，次氯酸由次氯酸和 氯離子在髓過氧化物酶（MPO)的催化作用下產(chǎn)生。作為一種重要的活性氧物種，次氯酸在 維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)起著非常重要的作用，但是一旦細胞中次氯酸的濃度發(fā)生 異常，就會引起包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的多種疾病，檢測生物體系中次 氯酸的濃度已成為一個重要的課題。
[0003] 然而目前對次氯酸的檢測缺少靶向性，不能對細胞內(nèi)某一特定的細胞器內(nèi)的次氯 酸進行檢測，特別缺少對細胞內(nèi)溶酶體靶向的次氯酸探針，從而缺少研究細胞病變過程中 對溶酶體中次氯酸濃度變化情況的檢測工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對目前次氯酸分子熒光探針檢測所面臨的問題的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設(shè)計， 合成出一種具有響應(yīng)時間快以及溶酶體靶向性的次氯酸熒光探針。
[0005] 本發(fā)明還提供了上述溶酶體靶向性的次氯酸熒光探針的制備方法和其在水環(huán)境 和生物細胞體系中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種溶酶體靶向次氯酸分子熒光探針，其特征在于，該探針分子式為：C37H35N5O5S,結(jié)構(gòu) 式如下：
[0007] 上述熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟： 1)將I.Omg的4-二乙氨基酮酸與776mg的4-苯并噻唑-1，3-間苯二酸溶于5ml甲 基磺酸中，氮氣保護，90°C加熱回流，反應(yīng)24h;用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液 冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入50ml冰水中，用甲醇/二氯甲烷=1:10萃取，無水硫酸鈉干 燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品用硅膠柱進行洗脫分離，可得到化合物L(fēng)yso-1，Lyso-I結(jié)構(gòu)式 如下：
2) 將300mg化合物L(fēng)yso-I溶于IOml無水乙醇中，加入2ml水合肼，氮氣保護，100°C加 熱回流，反應(yīng)30min，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，旋干，并用娃 膠柱進行洗脫分離，可以得到化合物L(fēng)yso-2,結(jié)構(gòu)式如下：
3)將150mg化合物L(fēng)yso-2溶于5ml氯仿中，在0°C加入15ML三乙胺和64mg氯乙酰 氯，逐漸升至室溫，在室溫下攪拌24h，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，加入ImL水淬滅反 應(yīng)，用50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)，用水20mL*2洗滌后用20mL*l的飽和食鹽水洗滌，無水 硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行洗脫分離，可以得到化合物L(fēng)yso-3， 結(jié)構(gòu)式如下：
4) 將IOOmg化合物L(fēng)yso-3溶于5mlDMF后，加入34mg碳酸鉀和41mg碘化鉀，室溫下 攪拌30min，然后逐滴加入43mg嗎啉，在室溫下攪拌過夜，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后， 加入ImL水淬滅反應(yīng)，用50mL二氯甲燒稀釋反應(yīng)，用水20mL*2洗滌后用20mL*l的飽和 食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行洗脫分離，可以得 到目標探針化合物，簡記為Lys0-ClO0
[0008] 上述次氯酸熒光探針的合成路線如下：
所述步驟1)中硅膠柱洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0009] 所述步驟2)中硅膠柱洗脫劑配比為乙酸乙酯：石油醚=1:1。
[0010] 所述步驟3)中硅膠柱洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0011] 所述步驟4)中硅膠柱洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷=1:30。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，該探針用于水環(huán)境中和生物 細胞體系中次氯酸的含量傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成 像檢測。
[0013] 該熒光探針用于檢測生物體系中細胞內(nèi)溶酶體中的次氯酸的檢測，與商業(yè)化溶酶 體綠進行共定位實驗，其共定位系數(shù)為〇. 98,因而此探針可以作為細胞內(nèi)溶酶體內(nèi)次氯酸 檢測探針。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點是：（1)探針的合成比較容易，且后處理過程相對簡單；（2)本發(fā)明 實現(xiàn)了次氯酸分子探針的選擇性快速檢測，并且選擇性好，抗其他分子干擾能力強。此外， 用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化，是 一種具有生色傳感功能的熒光探針。（3)此探針可以應(yīng)用于檢測生物體系中細胞內(nèi)溶酶體 中的次氯酸的檢測，通過與商業(yè)化溶酶體染料進行比較，發(fā)現(xiàn)此熒光探針對溶酶體內(nèi)次氯 酸成像的重合率高，兩種染料的共定位系數(shù)為〇. 98,說明此探針可以作為細胞內(nèi)溶酶體內(nèi) 次氯酸檢測探針。基于此探針的特異性且顯著的顏色變化，其試劑也可作為顯示水溶液中 次氯酸分子存在的專一性指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明 是一種簡單，快速，靈敏的次氯酸分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng) 用前景。
【附圖說明】
[0015] 圖1是實施例1中探針Lyso-ClO的1HNMR圖譜； 圖2是探針Lyso-ClO隨次氯酸的加入熒光譜圖的變化情況； 圖3是探針Lyso-ClO對不同離子和分子的選擇性熒光譜圖； 圖4是探針Lyso-ClO對不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)，其中1、空白；2、Co2+; 3、Cu2+; 4、Ni2+; 5.Br; 6.I-，； 7.NO2; 8.NO32; 9.OH; 10、S2;ll、Cys; 12、GHS; 13、Hcy; 14、過氧叔丁醇；15、過氧叔丁醚；16、H2O2; 17、NO; 18、HC10; 圖5是探針Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液顏色的變化圖； 圖6是探針Lyso-ClO溶液在次氯酸加入前后溶液用紫外燈照射后熒光顏色的變化 圖； 圖7是探針Lyso-ClO次氯酸熒光探針檢測外源性次氯酸熒光成像圖，其中a)只有探 針離子Lyso-ClO(5yM)熒光成像明場圖；b)只有探針離子Lyso-ClO(5yM)藍通道成 像圖；c)只有探針離子Lyso-ClO紅通道成像圖，d)明場與熒光成像圖重疊圖；e)探針濃 度為5yM加入到SiHa細胞中培養(yǎng)30min后加入20yM次氯酸3min后明場圖，f)對加入 次氯酸后藍通道熒光成像圖；g)對加入次氯酸后紅通道熒光成像圖；h)明場e與熒光成像 h，g圖重置圖片； 圖8是探針Lyso-ClO次氯酸熒光探針檢測外源性次氯酸熒光成像圖與商業(yè)化染料 溶酶體紅的共定位成像圖，其中a)探針濃度為5yM與溶酶綠紅加入到A549細胞中培養(yǎng) 30min后明場圖，b)商業(yè)染料溶酶體綠熒光成像圖c)加入次氯酸后探針分子紅熒光成像 圖，d)綠通道與紅通道疊加圖，e)綠通道與紅通道疊加箭頭部分熒光強度比較，f)綠通 道與紅通道疊加強度散點圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0017] 實施例1 目標探針化合物L(fēng)yso-ClO的制備 (1) 化合物L(fēng)yso-I的合成 4-二乙氨基酮酸（1.0g，3. 19mmol,Ieq)與4-苯并噻唑-1,3-間苯二酸（776mg， 3. 19mmol, 2eq)溶于5mL甲基磺酸溶液中，氮氣保護，90°C加熱，反應(yīng)24h。用TCL板 檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入50mL冰水中，用甲醇/二 氯甲烷=1:10萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠 顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷=1:30,產(chǎn)率為64%。合成路線如下：
(2) 化合物L(fēng)yso-2的合成 化合物L(fēng)yso-I(300mg，0. 574mmol,Ieq)溶于IOmL無水乙醇中，加入2mL水合肼， 氮氣保護，100°C加熱回流，反應(yīng)30min，用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液冷卻至 室溫，旋干，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為乙酸乙酯/石 油醚=1:1，產(chǎn)率為85%。合成路線如下：
(3) 化合物L(fēng)yso-3的合成 化合物L(fēng)ys〇-2(150mg，0. 41mm