一種熒光探針及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術領域,具體設及一種巧光探針及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 有機體壽命受多重復雜因素的影響,例如細胞機制和環(huán)境。大量證據(jù)表明細胞能 量代謝與ROS密切相關。然而,到目前為止,關于ROS的作用方面還沒有一致的觀點。許多 研究發(fā)現(xiàn)ROS參與到細胞損傷中因此加速老化過程。但是,也有許多人發(fā)現(xiàn)ROS信號轉(zhuǎn)導 的作用會延緩與老化相關的疾病或者是老化本身。運些爭議存在是由缺少理想的工具用于 精確監(jiān)測生物體系中ROS變化的困難引起的。考慮到〇2 是第一個產(chǎn)生的ROS而且能夠 轉(zhuǎn)化成其他R0S,靈敏、瞬時的在活體中示蹤化?對于理清〇2'與壽命的關系有著重要作 用。巧光成像的檢測方法提供了高的時空分辨率,同時對細胞損傷小,所W越來越多的被認 為是一種檢測生物活性小分子的有力工具。然而具有更好的光學性能的用于可視化活體中 〇2 的巧光探針仍然非常缺少。
[0003] 雙光子巧光顯微鏡(TPFM)在活體成像領域有著廣泛的應用前景,其中包括生物 傳感,腫瘤學,神經(jīng)科學W及胚胎學,因為TPFM應用了兩個能量更低的光子激發(fā)從而增加 了組織的穿透深度和減少了光損傷。因此,大量的TP巧光探針被成功的應用于檢測活細胞 和活體中的生物活性小分子。為了研究復雜環(huán)境中化水平對有機體壽命的影響,迫切需 要建構能夠動態(tài)成像〇2'變化的TP巧光探針,同時該探針還需要具有良好的選擇性,高的 TP吸收截面積W及深的穿透深度。但是,目前滿足要求的用于可視化活組織和完整有機體 中〇2 的TP巧光探針仍然非常缺少。因此為了解決上述問題,新的成像0 2'巧光探針的 光學性能需要大大提高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 針對上述現(xiàn)有技術,本發(fā)明的目的是提供一種巧光探針及其制備方法與應用,該 巧光探針具有靈敏度、選擇性好W及光穩(wěn)定性好的優(yōu)點。 陽〇化]為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術方案為:
[0006] 一種巧光探針,其結構式如下式I所示:
[0007]
[0008] 上述巧光探針的制備方法,包括如下步驟:
[0009] DPY-N02 (2, 5-二(4,-硝基苯乙締基)化嗦)的制備:
[0010] 將對硝基苯甲醒,2, 5-二甲基化嗦和催化劑混合得到混合液,將混合液加熱至 150-180°C,反應,得到PY-N02 ; W11] 。2, 5-二(4'-氨基苯乙締基)化嗦(PY-N肥)的制備: 陽01引在步驟1)得到的PY-N02中加入多硫化鋼,反應,得到PY-NH2 ;
[0013] 3)巧光探針的制備:
[0014] 將PY-N肥、咖啡酸、S乙胺、1-徑基苯并S挫化0BT)和1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽巧DC.肥L)加入到二氯甲燒和DMF的混合溶劑中得到混合液;所 述混合液在惰性氣體的保護下,攬拌,得到巧光探針的粗產(chǎn)品,純化后,得到巧光探針純品。
[0015] 優(yōu)選的,步驟1)中,所述2, 5-二甲基化嗦、對硝基苯甲醒和催化劑=者的物質(zhì)的 量之比為 1 :(1-2. 5) :(1-2. 5)。
[0016] 進一步優(yōu)選的,所述2, 5-二甲基化嗦、對硝基苯甲醒和催化劑=者的物質(zhì)的量之 比為1 :2 :2。
[0017] 優(yōu)選的,步驟1)中,所述催化劑為鄰苯二甲酸酢、苯甲酸酢或乙酸酢。運些催化劑 不但可W有效地提高2, 5-二甲基化嗦和對硝基苯甲醒的反應速率,還可W有效提高原料 的轉(zhuǎn)化率。
[0018] 優(yōu)選的,步驟1)中,所述混合液是在加熱回流的條件下反應的,回流的時間為 IO-ISho
[0019] 優(yōu)選的,步驟1)中,所述PY-N02的純化方法,包括如下步驟:將步驟1)中反應得 到的PY-N02粗產(chǎn)品用氯仿或二氯甲燒溶解,洗去PY-N02粗產(chǎn)品中的催化劑后,有機層通過 硅膠柱色譜分離后,得到PY-N02純品。
[0020] 進一步優(yōu)選的,洗去PY-N02粗產(chǎn)品中催化劑的溶液為飽和氨氧化鋼溶液、飽和碳 酸鋼溶液或飽和氨氧化鐘溶液。運些飽和溶液可W徹底地除去PY-N02粗產(chǎn)品中的催化劑, 使得到的PY-N02更純凈。 陽〇2U 優(yōu)選的,步驟2)中,PY-N02與多硫化鋼的物質(zhì)的量之比為1 :1-1 :10。
[0022] 優(yōu)選的,步驟2)中,PY-N02與多硫化鋼的混合物在95%的乙醇溶液中回流3-化, 回流溫度為78°C,制得PY-N肥。95%的乙醇溶液的沸點為78°C,可W保證在加熱反應的過 程中,反應物的溫度維持在78°C,既保證了反應速率,又減少了反應產(chǎn)生的副產(chǎn)物。 陽02引優(yōu)選的,步驟扣中,所述PY-N肥,咖啡酸,立乙胺,冊BT和邸C.肥L五者的物質(zhì)的 量比為1: (2-3. 5) : (2-3. 5) : (2-3. 5) : (2-3. 5)。其中,H0BT、邸C.肥L是反應催化劑,作用 是活化咖啡酸的簇基。
[0024] 優(yōu)選的,步驟3)中,PY-N肥和混合溶劑的比例為Immol: (8-30)ml。
[0025] 優(yōu)選的,步驟3)中,所述混合溶劑中,DMF和CH2CI2的體積比為1 :2-6。該組分配 比的混合溶劑可W充分溶解反應物,使反應順利進行。
[00%] 優(yōu)選的,步驟3)中,巧光探針粗產(chǎn)品的純化方法,包括如下步驟:將得到的粗產(chǎn)品 進行濃縮,將濃縮后的粗產(chǎn)品進行薄層色譜分離,洗脫劑為甲醇、甲苯和乙酸乙醋混合液, 其中,甲醇、甲苯和乙酸乙醋的體積比為1 :6-10 :2-6。該洗脫劑可W有效地將巧光探針洗 脫下來,而不會將其他雜質(zhì)洗脫下來,而且運種洗脫劑易與產(chǎn)物分離,保證了洗脫后的產(chǎn)品 的純度。
[0027] 進一步優(yōu)選的,所述洗脫劑中甲醇、甲苯和乙酸乙醋的體積比為1 :8 :4。
[0028] 本發(fā)明的巧光探針,單光子激發(fā)波長為400nm,雙光子激發(fā)波長為800nm,最大發(fā) 射波長為520皿。
[0029] 上述的巧光探針在檢測細胞內(nèi)或活體內(nèi)的超氧陰離子中的應用。
[0030] 上述的巧光探針檢測細胞或活體內(nèi)超氧陰離子的方法為:用含有巧光探針的溶 液解育細胞或活體,解育設定時間后,洗去多余巧光探針分子,然后進行激光共聚焦顯微成 像。 陽031] 優(yōu)選的,所述溶液為生理鹽水、緩沖范圍內(nèi)包括抑值為7. 4的緩沖液或水溶性有 機溶劑。
[0032] 優(yōu)選的,所述緩沖溶液的濃度為0. 01-0. 05mol/L。
[0033] 優(yōu)選的,所述含有巧光探針的溶液中的巧光探針的濃度為I-IOiimol/L。該濃度的 巧光探針可W對細胞或活體進行較好地成像。
[0034] 本發(fā)明的有益效果為:
[0035] (1)本發(fā)明的巧光探針的化學穩(wěn)定性,光物理穩(wěn)定性好;本發(fā)明的巧光探針在酸 性、中性和堿性等較寬的抑范圍內(nèi)對化都能響應敏感,與〇2'反應后的巧光強度至少可 W增強5倍,測定靈敏度較高,且響應時間極短。
[0036] (2)本發(fā)明的巧光探針對〇2 有很好的選擇性,過氧化氨化2〇2)、叔下基過氧化氨 (TBHP)、次氯酸根(0C1 )、單線態(tài)氧(1〇2)、過氧化亞硝酷(ONOO)、徑基自由基(?OH)、一氧 化氮(NO),W及金屬離子化化2\化2\Cu+與化2+對檢測沒有干擾;探針分子細胞滲透性 好,對細胞沒有毒副作用,適于細胞內(nèi)化濃度變化的檢測。
[0037] (3)本發(fā)明的巧光探針對〇2的響應為可逆反應,可逆反應可W實現(xiàn)動態(tài)、實時的 觀察〇2 的變化。
[0038] (4)本發(fā)明的巧光探針的合成步驟簡單,容易純化。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明的探針I(yè)的雙光子巧光強度和化變化的關系,其中,橫坐標為波長 (nm),縱坐標為巧光強度; W40]圖2為本發(fā)明的探針I(yè)的巧光強度和不同濃度的〇2 的滴定曲線,其中,橫坐標為 波長(nm),縱坐標為巧光強度,右上的小圖橫坐標為〇2濃度,縱坐標為巧光強度;
[0041] 圖3為本發(fā)明的探針I(yè)的選擇性示意圖。IOiiM本發(fā)明的探針I(yè)對不同的活性氧 和活性氮60min內(nèi)的巧光響應(20mM &〇2, 200 y M TBHPJOOyM NaClOJOOyM 1〇2, 33 y M 0N00-,200 yM'0H,200 yM NO W及〇2' 20 yM),圖標為不同的測試時間(0到60min)。 陽0創(chuàng)圖4為本發(fā)明的探針I(yè)對HepG2細胞內(nèi)〇2的雙光子原位成像。其中,圖中,b,d為2-甲基雌二醇刺激后肝癌細胞成像;C,e為加入〇2抗壞血酸后的巧光成像。
【具體實施方式】
[0043] 結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明,應該說明的是,下述說明僅是為了解 釋本發(fā)明,并不對其內(nèi)容進行限定。 W44]實施例1 :PY-NH2的合成W45] 步驟如下: