D1與活Cos7細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時，染料能夠特異性標(biāo) 記出細(xì)胞的溶酶體，并具有較高的熒光強(qiáng)度。
[0048] 兩親性吲哚方酸菁染料的毒性測試：
[0049] 將不同濃度的兩親性Π引噪方酸菁染料D1，商業(yè)化染料Dil及LysoTracker分別與 果蠅S2細(xì)胞儀器培養(yǎng)24小時，檢測細(xì)胞存活率，高濃度下與D1 -起培養(yǎng)的細(xì)胞存活率仍 尚于80 %。
[0050] 兩親性吲哚方酸菁染料用于長效溶酶體動態(tài)監(jiān)測：
[0051] 將D1與商業(yè)化染料LysoTracker與活Cos7細(xì)胞一起培養(yǎng)，在0到48小時內(nèi)觀察 二者的熒光。LysoTracker僅在2小時內(nèi)有較高的熒光強(qiáng)度，但D1直到48小時還有很強(qiáng)的 熒光，表明D1可用于長時間標(biāo)記溶酶體，實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞。
[0052] 實施例2 :
[0053] 1.將lg(4. 5mmol)苯肼鹽酸鹽及0. 54(6. 3mmol)3_甲基-2- 丁酮加入到10mL的 冰醋酸中，回流反應(yīng)12小時，懸蒸除去溶劑后，用二氯甲烷溶解，并用飽和NaHOVK溶液反 復(fù)洗滌至水相無色、pH中性，取有機(jī)相旋蒸除去溶劑，得到2, 3, 3-三甲-3H-基吲哚0. 77g， 產(chǎn)率71% ;
[0054] 2.將0·72g(3mmol)2,3,3-三甲-3H-基吲哚與0·96g(4. 5mmol)的對卞溴基苯甲 酸加入15mL乙腈，回流反應(yīng)20小時，旋蒸除去溶劑后用乙醚沉淀并多次洗滌，干燥后得到 中間產(chǎn)物吲哚啉衍生物〇. 96g，產(chǎn)率72% ;
[0055] 3.將 836mg(2mmol)吲噪啉衍生物與 114mg(lmmol)的 3, 4-二羥基-3-環(huán)丁 烯-1，2-二酮（方酸）加入10mL甲苯正丁醇（體積比為1 :1)混合液中，并加入5mL吡啶， 在氮氣保護(hù)下，緩慢升溫至115°C，24小時后用乙醚沉淀得到中間產(chǎn)物吲哚方酸菁衍生物 52411^(0.7臟〇1)，產(chǎn)率70% ;
[0056] 4.將301mg(0. 4mmol)吲噪方酸菁衍生物、1. 52g(4mmol)2-(7_偶氮苯并三氮 唑）-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)和1. 32mL(8mmol)二異丙基乙胺（DIPEA)加 入5mmolN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，室溫下反應(yīng)15分鐘后加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙 二胺512mg(3.2mmol)，繼續(xù)室溫下反應(yīng)2小時后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基（Boc)保護(hù)的 吲哚方酸菁衍生物416mg，產(chǎn)率85% ;
[0057] 5.將264mg(0.2mmol)Boc保護(hù)的吲噪方酸菁衍生物與5mL三氟乙酸加入至5mL二 氯甲烷中，室溫下反應(yīng)2小時后旋蒸除去溶劑并用乙醚沉淀，得到兩親性吲哚方酸菁染料 D2 (180mg，產(chǎn)率98 % )，結(jié)構(gòu)式為：
[0058]
[0059]NMR(400MHz，MeOD)δ7. 87 (d,J= 7. 9Hz, 4H) , 7. 52 (d,J= 7. 3Hz, 2H), 7. 41(d,J= 8. 0Hz, 3H), 7. 37 - 7. 30 (m, 2H), 7. 23(dd,J= 19. 7, 7. 5Hz, 3H), 5. 97(s, 2H), 5. 48(s, 4H), 3. 65(m, 4H), 3. 16(m, 4H), 1. 80(s, 12H).13C匪R(100MHz,DMS0 ,δ) 179. 77, 169. 57, 166. 49, 157. 82, 142. 39, 141. 23, 138. 72, 133. 43, 127. 99, 126. 11, 124 .00, 122. 45, 110. 32, 87. 02, 48. 82, 45. 96, 38. 64, 37. 04, 26. 61.HRMS(ESI-T0F) :m/zcalcd for[M+H]+，749. 3815;found，749. 3761.兩親性吲哚方酸菁染料對活細(xì)胞溶酶體的特異性 標(biāo)記：
[0060] 將兩親性吲哚方酸菁染料D2與活Cos7細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時，染料能夠特異性標(biāo) 記出細(xì)胞的溶酶體，并具有較高的熒光強(qiáng)度。
[0061] 實施例3:
[0062] 1.將500mg(3. 2mmol)4_甲基苯肼鹽酸鹽及430mg(5mmol)3_甲基-2-丁酮加入 到10mL的冰醋酸中，回流反應(yīng)12小時，懸蒸除去溶劑后，用二氯甲烷溶解，并用飽和NaHC03 水溶液反復(fù)洗滌至水相無色、pH中性，取有機(jī)相旋蒸除去溶劑，得到5-甲基-2, 3, 3-三 甲-3H-基吲哚 450mg(2. 6mmol)，產(chǎn)率 81% ;
[0063]2.將 34011^(1.96111111〇1)5-甲基-2,3,3-三甲-3!1-基吲哚與 42211^(1.96111111〇1)的 對卞溴基苯甲酸加入lOmL乙腈，回流反應(yīng)20小時，旋蒸除去溶劑后用乙醚沉淀并多次洗 滌，干燥后得到中間產(chǎn)物吲哚啉衍生物608mg(l. 57mmol)，產(chǎn)率80% ;
[0064] 3.將 155mg(0· 4mmol)吲噪啉衍生物與 25mg(0· 22mmol)的 3, 4-二羥基 _3_ 環(huán)丁 烯-1，2-二酮（方酸）加入6mL甲苯正丁醇（體積比為1 :1)混合液中，并加入3mL吡啶， 在氮氣保護(hù)下，緩慢升溫至115°C，24小時后用乙醚沉淀得到中間產(chǎn)物吲哚方酸菁衍生物 19111^(0.28臟〇1)，產(chǎn)率69% ;
[0065] 4.將90mg(0. 13mmol)吲哚方酸菁衍生物、200mg(0. 52mmol)2-(7-偶氮苯并三氮 唑）-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)和136mg(l. 04mmol)二異丙基乙胺（DIPEA) 加入5mmolN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，室溫下反應(yīng)15分鐘后加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙 二胺104mg(0.64mmol)，繼續(xù)室溫下反應(yīng)2小時后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基（Boc)保護(hù)的 吲哚方酸菁衍生物83mg(0. 09mmol)，產(chǎn)率73% ;
[0066] 5.將54mg(0.05mmol)Boc保護(hù)的吲噪方酸菁衍生物與5mL三氟乙酸加入至5mL二 氯甲烷中，室溫下反應(yīng)2小時后旋蒸除去溶劑并用乙醚沉淀，得到兩親性吲哚方酸菁染料 D3 (39mg，產(chǎn)率93 % )，結(jié)構(gòu)式為：
[0067]
[0068]NMR(400MHz,MeOD)δ7. 87 (d,J= 8. 2Hz, 4H) , 7. 40 (d,J= 8. 2Hz, 4H), 7. 34 (s, 2H), 7. 16 (d,J= 8. 0Hz, 2H), 7. 08 (d,J= 8. 2Hz, 2H), 5. 92 (s, 2H) ，5.44(s，4H)，3.65(m，4H)，3. 16(m，4H)，2.41(s，6H), 1.78(s, 12H).13C匪R(100MHz，DM SO,δ) 180. 40, 178. 87, 169. 22, 166. 44, 141. 37, 140. 28, 138. 77, 133. 46, 128. 42, 127. 98, 127. 46, 126. 09, 123. 07, 110. 02, 86. 73, 69. 75, 48. 74, 45. 96, 37. 05, 26. 64, 20. 79. HRMS(ESI-TOF) :m/zcalcdfor[M+H]+, 777. 4128 ；found, 777. 4125.
[0069] 兩親性吲哚方酸菁染料對活細(xì)胞溶酶體的特異性標(biāo)記：
[0070] 將兩親性吲哚方酸菁染料D3與活Cos7細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時，染料能夠特異性標(biāo) 記出細(xì)胞的溶酶體，并具有較高的熒光強(qiáng)度。
[0071]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種兩親性嗎I噪方酸菁染料，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：其中，R為H，Br，或邸3。2. -種兩親性嗎I噪方酸菁染料的合成方法，其特征在于，其具體操作步驟為： 1) .將10-20mmol4-R基苯阱鹽酸鹽及l(fā)〇-24mmol3-甲基-2-下酬加入到5-20血的 冰醋酸中，回流反應(yīng)8-20小時，懸蒸除去溶劑后，用二氯甲燒溶解，并用飽和NaHC〇3水溶液 洗涂至水相無色、pH中性，取有機(jī)相旋蒸除去溶劑，得到5-R基-2,3,3-Ξ甲-3H-基嗎I噪； 2) .將3-lOmmol的5-R基-2,3,3-Ξ甲-3H-基嗎I噪與3-12mmol的對卞漠基苯甲酸加 入10-20mL乙臘中，回流反應(yīng)10-20小時，旋蒸除去溶劑后用乙酸沉淀并洗涂，干燥后得到 中間產(chǎn)物嗎I噪嘟衍生物； 3) .將l-5mmol步驟2)合成的嗎I噪嘟衍生物與0. 5-2. 5mmol的3, 4-二徑基-3-環(huán) 下締-1,2-二酬加入10-20mL甲苯和正下醇的混合溶液中，甲苯和正下醇的體積比為 1:0. 8-1. 5,并加入5-10血化晚；在氮氣保護(hù)下，緩慢升溫至100-120°C，15-30小時后用乙 酸沉淀得到中間產(chǎn)物嗎I噪方酸菁衍生物； 4) .將0. 5-lmmol步驟3)合成的嗎I噪方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并Ξ氮 挫）-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脈六氣憐酸醋和2-4mmol二異丙基乙胺加入5-lOmmolN，N-二甲 基甲酯胺中，室溫下反應(yīng)15-30分鐘后加入N-叔下氧幾基-1，2-乙二胺4-5mmol，繼續(xù)室溫 下反應(yīng)2-8小時后用乙酸沉淀得到叔下氧幾基保護(hù)的嗎I噪方酸菁衍生物； 5) .將0. 1-lmmol叔下氧幾基保護(hù)的嗎I噪方酸菁衍生物與5-10血Ξ氣乙酸加入至 5-lOmL二氯甲燒中，室溫下反應(yīng)2-10小時后旋蒸除去溶劑并用乙酸沉淀，得到兩親性嗎I噪 方酸菁染料； 步驟1)和2)中的R為H，Br，或邸3。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性嗎I噪方酸菁染料在活細(xì)胞中標(biāo)記溶酶體的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類兩親性吲哚方酸菁染料的合成及其在特異性溶酶體標(biāo)記方面的應(yīng)用。本發(fā)明使用4號位由溴、氫或甲基取代的苯肼鹽酸鹽為原料，制備得到帶有上述三種取代基且?guī)в恤然δ芑倪胚岱剿彷既玖?，然后通過羧基與伯胺的縮合反應(yīng)進(jìn)一步將氨基引入染料分子。本發(fā)明設(shè)計合成的兩親性吲哚方酸菁染料紫外吸收和熒光發(fā)射均位于近紅外區(qū)，在生物成像過程中可大大降低背景熒光的干擾；該染料具有水溶性，不依賴有機(jī)助溶劑可直接用于生物成像，有較低的生物毒性；該染料的氨基在溶酶體酸性環(huán)境下充分質(zhì)子化，與溶酶體膜的靜電作用更加強(qiáng)烈，因而可以標(biāo)記活細(xì)胞的溶酶體，標(biāo)記持續(xù)時間可達(dá)48小時以上。吲哚菁類染料在溶酶體標(biāo)記方面的應(yīng)用還屬首次。
【IPC分類】C09B23/10, G01N21/64
【公開號】CN105238093
【申請?zhí)枴緾N201510558040
【發(fā)明人】尹梅貞, 冀辰東, 沈杰, 鄭洋
【申請人】北京化工大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月2日