一種檢測(cè)硫化氫的比率熒光探針及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明設(shè)及一種硫化氨巧光探針，尤其設(shè)及一種檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針及其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子巧光探針領(lǐng)域。【
背景技術(shù)：
】[000引硫化氨化巧作為內(nèi)源性氣體傳感信號(hào)分子的一種，充當(dāng)抗氧化劑和活性氧的清除劑。然而，硫化氨濃度異常會(huì)引起許多疾病，例如，阿爾茨海默病，唐氏綜合癥和糖尿病等。因此，定量檢測(cè)生物系統(tǒng)中的硫化氨引起廣泛的關(guān)注。[0003]巧光檢測(cè)法具有操作方便，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。然而，已報(bào)道的硫化氨探針大多是巧光"關(guān)-開"型（參見X.Li,S.Zhang,J.Cao,N.Xie,T.Liu,B.Yang,Q.-J.HeandY.-Z.Hu,AnICT-basedfluorescentswitch-onprobeforhydrogensulfideinlivingcells,Chem.Commun.,2013,49:8656-8658;Z.-J.Huang,S.-S.Ding,D.-H.化，F(xiàn).-H.HuangandG.-Q.Feng,Aldehydegroupassistedthiolysisofdinitrophenylether:anewpromisingapproachforefficienthydrogensulfideprobes,Chem.Commun.,2014,50:9185-9187；X.-Y.如，C.-J.Li,H.-C.Chen,J.Mack,Z.-J.GuoandZ.aien)，易受到檢測(cè)環(huán)境，如檢測(cè)溫度、探針濃度等條件的影響化Komatsu,Y.Urano,H.KojimaandT.化gano,DevelopmentofanIminocoumarin-BasedZincSensorSuitableforRatiometricFluorescenceImagingof化uronalZinc,J.Am.Chem.Soc.，2007,129:1:3447-1:3454)。然而，比率型巧光探針可W有效解決W上問題。因此，開發(fā)具有細(xì)胞成像能力，而且可W比率檢測(cè)硫化氨的巧光探針成為目前亟待解決的課題。[0004]巧光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是設(shè)計(jì)比率巧光探針的一種重要檢測(cè)機(jī)理。FRET過程需要兩個(gè)條件：1、供體的發(fā)射譜與受體的吸收譜有足夠的重疊，2、供體和受體之間有合適的距離（約10-100A)。香豆素巧光團(tuán)本身具有較大的量子產(chǎn)率，適合作為巧光供體，半川菁巧光團(tuán)具有吸收和發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的特點(diǎn)，適合作為巧光受體。另外，贓嗦作為供體和受體之間的連接基團(tuán)在基于FRET機(jī)理的探針中獲得應(yīng)用。然而，如何選擇供體和受體，使FRET效率更高，如何提高對(duì)識(shí)別分子的選擇性、靈敏性W及改善其他應(yīng)用性能（如響應(yīng)時(shí)間、穩(wěn)定性、透膜性、低毒性等），目前尚無規(guī)律可循?；诖?，有關(guān)基于FRET機(jī)理檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針及其應(yīng)用還未見報(bào)道。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種基于FRET機(jī)理檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針及其應(yīng)用。[0006]本發(fā)明的核屯、在于利用香豆素作為能量供體，半川菁作為能量受體構(gòu)筑FRET體系，運(yùn)尚屬首次。當(dāng)用香豆素部分的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)探針的時(shí)候，由于FRET打開，探針發(fā)射半川菁部分的巧光；當(dāng)硫化氨存在的時(shí)候，半川菁與硫化氨發(fā)生親核加成反應(yīng)，半川菁巧光團(tuán)共輛體系斷裂，運(yùn)時(shí)FRET受到抑制，再用相同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)探針的時(shí)候，探針會(huì)發(fā)出香豆素部分的巧光。通過上述方案，實(shí)現(xiàn)"比率計(jì)型"的巧光響應(yīng)，使探針的靈敏度得到大幅度提局。[0007]本發(fā)明所述的檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針，其特征在于：所述比率巧光探針是由香豆素巧光團(tuán)作為供體，半川菁巧光團(tuán)作為受體，通過贓嗦聯(lián)接構(gòu)筑成基于巧光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)機(jī)理檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針，該比率巧光探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I)所示(簡(jiǎn)稱CPC):[0008][0009]上述檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針（式（I)所示化合物）的制備方法，步驟如下：[0010]步驟1:由已知方法合成4-贓嗦基苯甲醒和7-二乙胺基-3-香豆素酷氯，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，二者加入到干燥的二氯甲燒中，加入=乙胺，反應(yīng)得到式（II)所示化合物。[0011][0012]步驟2:在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，式（II)所示化合物與1，2,3,3-四甲基嗎I噪艦化鹽在乙醇中回流即得到式（I)所示化合物。[0013]本發(fā)明所述的探針自身發(fā)紅色巧光，當(dāng)硫化氨存在的時(shí)候，探針與其發(fā)生親核加成反應(yīng)，抑制FRET進(jìn)程，從而達(dá)到比率檢測(cè)的效果。加成產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。[0014]本發(fā)明所述檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針在檢測(cè)含硫化氨樣品中的應(yīng)用。[0015]上述應(yīng)用中：所述含硫化氨樣品優(yōu)選是含外源性硫化氨或內(nèi)源性硫化氨的生物細(xì)胞，或是含硫化氨的溶液。其中所述生物細(xì)胞優(yōu)選是化La細(xì)胞。[001引具體的：配制檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針仰C)的PBS緩沖液化2M，抑=7.4)的溶液，分別加入定量的和Cl，CH3CO2，成成，SO32，Br，肥03，SO42，EDA,邸3畑2,CO(畑2)2，CS(畑2)2,&02,畑3.&0,I，肥10,G甜，化y,切S,NO,02，K+，化+，Ca2+的水溶液。通過紫外可見分光光度法和巧光分光光度法測(cè)試其對(duì)不同硫醇、常見陰陽離子的選擇性和響應(yīng)能力。結(jié)果顯示探針對(duì)硫化氨有很好的選擇性，兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)相差113nm，具有非常好的比率響應(yīng)。見圖2,3。[0017]配制檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針（CPC)的PBS緩沖液（0.2M，抑=7.4)的溶液，向其加入硫化氨且硫化氨的濃度依次遞增，如圖4所示，探針在587nm處的巧光逐漸減弱，在474nm處的巧光逐漸增強(qiáng)。探針對(duì)硫化氨的響應(yīng)非常靈敏，檢測(cè)限為40nM，如圖5所示。[001引在加入3.0yM的巧光探針CPC的化La細(xì)胞中不加入或加入硫化氨，觀察細(xì)胞巧光顯微成像變化。巧光成像顯示：探針滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，并隨著硫化氨濃度增加，紅色巧光逐漸減弱，相應(yīng)地，藍(lán)色巧光逐漸增強(qiáng)，見圖6。[0019]在加入2.0yM的巧光探針CPC的化La細(xì)胞中不加入或加入半脫氨酸，觀察細(xì)胞巧光顯微成像變化。巧光成像顯示：加入半脫氨酸的一組，紅光明顯減弱，藍(lán)光有所增強(qiáng)，見圖7。[0020]本發(fā)明所述檢測(cè)硫化氨的比率巧光探針在細(xì)胞內(nèi)的線粒體定位中的應(yīng)用。[002。在加入3.0yM的巧光探針CPC的化La細(xì)胞中繼續(xù)加入0.3yM線粒體紅，進(jìn)行共聚焦成像。巧光成像顯示：a組收集藍(lán)光部分，C組收集紅光部分，如圖8所示，預(yù)示本發(fā)明的探針可W進(jìn)行線粒體定位。[0022]本發(fā)明提供的硫化氨比率巧光探針可W選擇性地與硫化氨作用，具有巧光比率響應(yīng)效應(yīng)、選擇性強(qiáng)、不受生物硫醇的干擾、靈敏度高、響應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)?？蒞比率檢測(cè)硫化氨，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的外源性和內(nèi)源性硫化氨比率成像，另外探針可W進(jìn)行線粒體定位，有望在生物科學(xué)中發(fā)揮作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。[0023]本發(fā)明具有如下特點(diǎn)：[0024]1)本發(fā)明提供的巧光探針對(duì)硫化氨選擇性專一，而且成比例檢測(cè)。[0025]2)本發(fā)明提供的巧光探針是新型的FRET比例探針。[0026]3)本發(fā)明提供的巧光探針對(duì)硫化氨靈敏度高，檢測(cè)限為40nM。[0027]4)本發(fā)明提供的巧光探針對(duì)硫化氨響應(yīng)快速。[0028]5)本發(fā)明提供的巧光探針可W檢測(cè)化La細(xì)胞中的外源性和內(nèi)源性硫化氨。[0029]6)本發(fā)明提供的巧光探針可W定位線粒體檢測(cè)硫化氨?！靖綀D說明】[0030]圖1為巧光探針CPC與硫化氨加成產(chǎn)物的LCQFleet質(zhì)譜。[0031]圖2為巧光探針CPC的PBS緩沖液（0.2M，抑=7.4)的溶液加入常見陰陽離子和多種硫醇的紫外吸收?qǐng)D譜。[0032]圖3為巧光探針CPC的PBS緩沖液（0.2M，抑=7.4)的溶液加入常見陰陽離子和多種硫醇的巧光比例（1587/1474)柱狀圖。（1^7為探針在58711111處的巧光強(qiáng)度，1474為探針在474nm處的巧光強(qiáng)度）[0033]圖4為巧光探針CPC的PBS緩沖液（0.2M，抑=7.4)的溶液中加入依次遞增濃度硫化氨的巧光滴定圖譜。[0034]圖5為巧光探針CPC的PBS緩沖液化2M，抑=7.4)的溶液加入依次遞增濃度硫化氨的巧光當(dāng)前第1頁1 2