一類基于熱致延遲長壽命熒光有機材料納米顆粒的制備方法及其時間分辨生物成像應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及合成具有熱致延遲熒光（TADF)特性的長壽命有機熒光分子及其水溶 性長壽命納米顆粒的制備方法和生物成像應用。屬于有機發(fā)光材料及納米生物探針與成像 領域。
【背景技術】
[0002] 熒光顯微成像技術作為一種無損傷生物傳感技術，在細胞成像、活體、體外組織成 像中成為一種必不可少的關鍵技術。熒光顯微成像技術的核心是發(fā)展具有熒光效率高、光 穩(wěn)定性好的熒光發(fā)色團。目前常見的熒光發(fā)色團包括：傳統熒光素、羅丹明、花菁類有機染 料、無機半導體納米晶、共輒聚合物等。其中傳統有機小分子熒光染料因其可設計性強，成 為生物傳感和臨床應用的主要選擇。然而現有的有機染料仍面臨一些問題如疏水性、易聚 集、易于光漂白等。而，無機半導體納米晶，如量子點等，雖然具有高亮度、高光穩(wěn)定性的優(yōu) 勢，但是自身毒性卻亟待解決。此外，一般的熒光染料在生物成像中應用易受生物體系內源 背景熒光的干擾、靈敏度和信噪比均相對較低、信號易受環(huán)境影響。由于生物體內源熒光一 般壽命為幾個納秒或者零點幾個納秒，這樣，發(fā)展具有長熒光壽命的熒光發(fā)色團，可利用時 間分辨技術規(guī)避樣品中熒光背景的干擾，從而實現高靈敏、高信噪比的成像。
[0003]目前，長壽命熒光成像主要基于無機稀土材料、稀土配合物及貴、重金屬的磷光發(fā) 射，然而這種磷光長壽命信號往往因為需要在乏氧條件下才能保持。因此，發(fā)展空氣或者氧 氣氣氛下具有長壽命熒光、高熒光量子效率、水溶性好的熒光探針具有重要的科學研究和 市場價值。
[0004] 近年來，納米技術日益成為科學技術向前發(fā)展的主導技術。將有機小分子熒光染 料與納米技術相結合，通過負載有機小分子染料的納米顆?；蛉玖闲》肿幼跃奂纬杉{米 顆粒，利用形成的納米結構控制、影響并提高材料的相關性能從而使之得到更好的應用是 有機小分子熒光染料發(fā)展的重要方向。

【發(fā)明內容】

[0005] 發(fā)明目的：本發(fā)明目的之一是提供一種具有長壽命熒光的有機半導體熒光材料； 目的之二是提供該有機小分子染料包覆于水溶性的DSPE-PEG2000中以形成水溶性熒光納 米顆粒的方法；目的之三是提供該納米有機小分子染料納米顆粒在細胞成像、活體成像中 應用的范例。
[0006] 技術方案：為克服現有技術的不足，我們選擇設計、合成用具有熱致延遲熒光特性 的有機半導體發(fā)光材料，并選擇適當手段使之具有水溶性和長熒光壽命，從而據有水溶性 好、熒光壽命長、熒光效率高、熒光光譜穩(wěn)定性好等特點的熒光顯微成像發(fā)色團。該納米材 料的特征在于：將有機小分子熒光材料與納米技術結合，得到的納米顆粒穩(wěn)定性高，熒光壽 命長，熒光量子產率高，并具有好的生物相容性和低的生物毒性。
[0007] 本發(fā)明給出一類基于熱致延遲熒光有機熒光材料的水溶性長壽命熒光納米顆粒 的組成結構，其中本發(fā)明所述的納米結構如附圖1所示，TADF材料CzPy結構式如通式（I) 所示：
[0009] 其中，CzPy納米顆粒結構中星型圖案表示CzPy分子的聚集體，外表的曲線圖案代 表卵磷脂-聚乙二醇（DSPE-PEG2000)分子，其親水端在外，提供水溶性；親脂端融合CzPy 分子聚集體，形成納米發(fā)光體核心。
[0010] CzPy所代表的TADF材料結構通式（I)中，Py為吡啶分子，Cz為類咔唑分子，其中 Arl和Ar2分別表示苯、噻吩、芴、咔唑、萘、蒽等芳基、取代芳基、雜環(huán)芳基以及取代雜環(huán)芳 基中的一種，4個Cz結構通過其9位氮原子與核心的4-氰基P比啶相連。
[0011] 本發(fā)明所述的CzPy所代表的TADF分子，其特征結構通式式⑴中，Arl和Ar2與 吡咯并環(huán)結構的合成是通過硝基關環(huán)反應實現。其制備方法可以下述反應通式（II)表示。
[0013] 合成方案通式（II)中，Arl和Ar2所代表的基團分別為苯、噻吩、芴、咔唑、萘、蒽等 芳基、取代芳基、雜環(huán)芳基以及取代雜環(huán)等芳香基團中的一種；X可以為溴原子或碘原子，Y 可以為硼酸基、硼酸酯基或三烷基錫基的一種。
[0014] 本發(fā)明公開的TADF有機半導體材料合成方法主要分三步進行，如通式（II)所示： (1)，步驟1) 一般為Suzuki偶聯反應或者Stille偶聯反應；當步驟1)為Suzuki偶聯反應 時，需要用到含鈀催化劑和無機堿的水溶液，溶劑一般為甲苯或者四氫呋喃，在回流下反應 16~24小時得到III-3 ;當步驟1)為Stille偶聯反應時，需要用含鈀催化劑在甲苯或四 氫呋喃溶液中回流反應5~24小時，經硅膠柱層析得到化合物111-3。鈀催化劑可以選擇 卩(1(??11 3)4或者？(13(^32/?(〇-1:〇1)3;51^111^偶聯反應中使用的堿溶液可以是21]1〇1/1的碳酸 鉀、碳酸鈉或者碳酸氫鈉溶液。（2)，步驟2)為獲得Cz分子的關環(huán)步驟，其特征在于關環(huán)試 劑是三苯基膦或三乙氧基膦，所用的溶劑是氯苯、鄰二氯苯，反應溫度為125~145°C，反應 時間為6~12小時。化合物III-3與關環(huán)試劑、溶劑的摩爾比大約為lmmol:2. 5mmol:2mL。 (3)，步驟3)所需的溶劑為無水無氧的二甲亞砜，反應溫度為KKTC~150°C，反應時間為 12~24小時。
[0015] 本發(fā)明公開的基于TADF有機半導體材料CzPy的水溶性長壽命熒光納米顆粒的制 備方法，其特征是經過三個步驟。步驟一，將2mg的CzPy溶解于2mL四氫咲喃中，加入2mg 的DSPE-PEG2000，超聲混合均勻，并保持10分鐘，形成透明溶液。步驟二，取步驟一的溶液 0. 5mL快速注入IOmL的pH = 7. 4的PBS或去離子水溶液中；氮氣流下除去四氫呋喃。步 驟三，將步驟二所得納米顆粒水溶液經0. 22微米微孔過濾頭濾過，并旋轉蒸發(fā)除去大部分 溶劑水，剩余水經冷凍干燥除去，得到目標納米顆粒粉末。
[0016] 本發(fā)明公開的CzPy納米顆粒及其制備方法，長壽命熒光分子與DSPEG-2000的重 量比為1:3~3:1 ;旋轉蒸發(fā)除水。
[0017] 本發(fā)明公開的一類純有機長壽命熒光納米顆粒及其制備方法，其步驟三所得到的 納米顆粒粒徑為10~50納米（如圖4);其在空氣中測定的熒光壽命達到微秒級（如圖3)。
[0018] 本發(fā)明公開的該類納米顆粒對HELA細胞進行染色標記（如圖5)以及對斑馬魚血 管具有良好的成像效果（如圖6)。
[0019] 有益效果：
[0020] 1、本發(fā)明所公開基于熱致延遲熒光有機半導體材料的水溶性長壽命熒光納米顆 粒，充分利用具有擁擠芳香體系的TADF材料在聚集狀態(tài)下具有比溶液態(tài)更強的熒光發(fā)射；
[0021] 2、利用DSPE-PEG2000作為增溶試劑，通過快速沉淀法，穩(wěn)定、可控的制備具有尺 寸均一、信號穩(wěn)定的水溶性納米顆粒。
[0022] 3、最核心的優(yōu)勢是這種納米顆粒具有比普通有機或共輒材料更好的熒光壽命穩(wěn) 定性和更長的熒光壽命，即便在空氣中測定和操作使用，都達到了微秒級的水平，這使得 本發(fā)明公開的一類長壽命納米顆粒在細胞成像、活體或組織成像中，通過時間分辨技術克 服背景熒光干擾方面有無以倫比的優(yōu)勢。
[0023] 4、本發(fā)明公開的基于熱致延遲熒光有機半導體材料的水溶性長壽命熒光納米顆 粒有望在生物成像、細胞成像等傳感檢測領域得到廣泛的應用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為制得的CzPy納米顆粒結構示意圖；
[0025] 圖2-1為制得的長壽命熒光有機小分子紫外熒光譜圖；
[0026] 圖2-2為有機小分子及其納米顆粒的熒光對比圖；
[0027] 圖3為有機納米顆粒的熒光壽命圖；
[0028] 圖4為有機納米顆粒透射電子顯微鏡圖；
[0029] 圖5為有機納米顆粒細胞成像共聚焦顯微鏡照片；（制備得到的納米顆粒在細胞 膜處成像為綠色熒光。）
[0030] 圖6為有機納米顆粒在斑馬魚血管成像共聚焦顯微鏡照片。（納米顆粒在斑馬魚 血管成像具有很好的分辨率，在斑馬魚上較亮部分即成像顯示為綠色熒光。）
[0031]
[0032]
[0033] 具體實施例
[0034] 為了更清楚的闡述本發(fā)明，下面通過具體實施例子來對本發(fā)明做進一步說明，不 是對本發(fā)明的限制。
[0035] 實施例1
[0036] TADF 分子 CzPy-T 的制備
[0037] 在兩口瓶（IOOmL)中，將2-溴硝基苯（2. Olg，IOmmol)，2-噻吩硼酸 (I. 42g，Ilmmol)溶解在30mL甲苯中，注入2M碳酸鉀溶液20mL.抽換氣三次，氮氣保 護下，加入四（三苯基膦）鈀（150mg，0. 14mmol)，加熱至90°C，反應16小時。自然冷 至室溫，二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到亮黃色粉末1.85g，產率81 %。1H NMR(400MHz，CDCl3)S7.95(d，J = 1.9Hz，1H)，7.77 (dd，J = 8.1，1.9Hz，1H)，7.56 (d，J =8. 1Hz, 1H), 7. 42(d, J = I. 0Hz, 1H), 7. 39 (dd, J = 5. I, I. 1Hz, 1H), 7. 11 (d, J = I. 4Hz, 1H) · 13C NMR(101MHz, CDCl3) δ 141. 03, 132. 68, 128. 69, 128. 53, 127. 94, 127. 50, 127 .24, 127. 21, 126. 71, 124. 88, 120. 74〇
[0039] 在兩口圓底燒瓶（250mL)中加入2-硝基-苯聯噻吩（9. 37g, 33mmol)，三 苯基膦（22. 7g，IOOmmol)和氯苯（60mL)，氮氣保護，加熱至140 °C攪拌反應7小時， 冷至室溫，二氯甲烷萃取，濃縮，經柱層析分離得苯聯噻吩并吡咯粉末4. 83g，產率 70. 1 %。1H NMR(400MHz，CDCl3) δ 8. 21(br，1H)，7. 60(d，J = 6. 7Hz，2H)，7. 39(d，J = 5. 2Hz，1H), 7. 29(dd，J = 8. 4, I. 7Hz，1H)，7. 07(d，J = 5. 2Hz，1H). 13C NMR(101MHz，CDCl3) δ 143. 37, 141. 83, 127. 73, 123. 02, 121. 07, 119. 98, 117. 88, 116. 02, 114. 81，111. 51。
[0041] 在兩口瓶（250mL)中加入上述苯聯噻吩并吡咯（3.08g，18mmol)、2,3,5,6-四 氟-4-氰基吡啶（0. 72g，4mmol)，碳酸鉀（6. 9g，50mmol)和二甲亞砜（100mL)，氮氣保護 下，150 °C攪拌24h。二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥。濃縮，硅膠色譜柱分離得CzPy-T， 2.56g，產率 82 %。 1H NMR (400MHz，CDCl3) δ 8. 25 (br，2H)，7. 78 (m，2H)，7. 59 (d，J =8. 4Hz, 4H), 7. 50 (d, J = I. 6Hz, 4H), 7. 39 (d, J = 5. 2Hz, 4H), 7. 29 (dd, J = 8. 4, I. 7Hz, 2H)，7. 07 (d, J = 5. 2Hz, 2H)。13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 146. 16, 142. 42, 143. 3 7, 141. 83, 133. 9, 133. 5, 128. 5, 127. 29, 123. 02, 122. 03, 121. 30, 119. 97, 119. 90, 117. 88, I 16. 02, 115.